PI3K和MAPK信号通路通过FOXO1转录因子诱导A549细胞周期的阻滞和凋亡的研究

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路通过FOXO1转录因子对细胞周期及凋亡的调节及其分子机制.方法 体外培养NSCLC细胞系A549,分别选用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002和MAPK/ERK信号通路特异性抑制剂UO126及2种抑制剂联合处理细胞之后,采用Western blot检测蛋白FOXO1、p-FOXO1及其下游蛋白Bim、p27kip表达的变化;流式细胞术分析对细胞周期的影响;Annexin-FITC双染方法检测细胞凋亡.结果 Western blot结果显示:与对照组相比,FOXO1的蛋白水平未见明显变化,而FOXO1的磷酸化水平明显下降,Bim、p27kip的表达相应增加.与对照组相比,LY294002和UO126均可促进A549细胞周期阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡.LY294002和UO126联合作用较2种药物单独作用时,A549细胞凋亡明显增加.结论 抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路可共同激活FOXO1转录因子的活性,协同促进细胞周期的阻滞,诱导细胞的凋亡.     

A激酶锚定蛋白9提高ERK通路活性促进肺腺癌细胞A549增殖和迁移

目的：探讨A激酶锚定蛋白9（AKAP9）对肺腺癌细胞A549的作用及其可能的分子机制。方法：通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）法检测shRNA的沉默效果;通过MTT和克隆形成实验检测AKAP9对肺腺癌细胞A549增殖的影响;Transwell实验检测AKAP9对肺腺癌细胞A549迁移的影响;流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测周期相关蛋白P27、细胞周期素D1（Cyclin D1）、细胞周期素依赖性激酶4（CDK4）的表达和细胞外信号调节激酶（ERK）通路中表皮生长因子受体（EGFR）、ERK的磷酸化水平。结果：RT-qPCR和Western blot结果显示,shRNA可以有效地沉默肺腺癌细胞A549中AKAP9的表达（P ＜0.01）。MTT和克隆形成结果示,与对照组相比,沉默AKAP9显著抑制癌细胞A549的增殖和克隆形成能力（P ＜0.01）。Transwell实验示,与对照组相比,沉默AKAP9显著抑制癌细胞A549的迁移能力（P ＜0.01）。流式细胞术结果示,与对照组相比,沉默AKAP9可以诱导肺腺癌细胞G1-S期阻滞（P ＜0.01）。Western blot结果示,与对照组相比,沉默AKAP9增加细胞周期负性调控因子P27,减少正性调控蛋白Cyclin D1、CDK4的表达,并降低EGFR、ERK的磷酸化水平（P ＜0.01）。结论：沉默AKAP9可以通过抑制ERK通路活性减弱肺腺癌细胞A549增殖和迁移的能力。     

青石棉诱导A549细胞ERK1/2、MEK1/2的表达

目的:了解细胞内信号传导在石棉致肺部疾患过程中的作用。方法:用Western免疫印迹法检测石棉刺激的A549细胞裂解液中MEK1/2、:ERK1/2的表达。结果:以0.1 g/L浓度的青石棉刺激A549细胞后,ERK1/2、MEK1/2磷酸化蛋白快速高表达,与空白对照比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:磷酸化的信号蛋白可能在石棉致病中起重要作用。     

ERK及STAT3在机械力刺激肺泡上皮A549细胞信号传导中的作用

目的 研究机械张应力对肺泡上皮A549细胞MAPK信号通路蛋白ERK和JAK/STAT通路蛋白STAT3丝氨酸位点磷酸化水平表达的影响.方法 利用自制四点弯曲加力装置对A549细胞进行大小为3000 μ strain的张应力刺激,收集不同时间点(30 min, 1 h, 2 h, 4 h)的细胞总蛋白,用Western blot的方法检测磷酸化STAT3和ERK蛋白水平的变化.设未予机械力刺激的A549细胞为对照组.结果 ①用3000 μstrain的张应力刺激A549细胞后,p-ERK表达从1 h开始增加,和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).②用3000 μstrain的张应力刺激A549细胞后,p-STAT3(Ser)表达随时间增加,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 MAPK家族中的ERK和STAT家族中的STAT3可能参与了机械力刺激肺泡上皮细胞的信号传导.     

A549细胞中NOX4介导IL-6自分泌及细胞侵袭的研究

目的 观察在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549中NADPH氧化酶4(NOX4)对炎症因子IL-6表达的影响,并研究NOX4、IL-6对A549细胞侵袭过程的作用.方法 通过质粒pCMV-NOX4转染细胞,制备NOX4稳定过表达的A549细胞株,采用RT-PCR及Western blotting法对NOX4的表达进行检测;采用ELISA法检测IL-6的分泌水平;采用侵袭小室法检测A549细胞的侵袭能力;采用Western blotting法检测磷酸化Akt表达水平.结果 与对照组相比,经质粒pCMV-NOX4转染后,A549细胞中NOX4的mRNA表达和蛋白表达水平均显著升高;NOX4过表达的A549细胞中IL-6表达量增高;NOX4过表达可促进A549细胞的侵袭能力及上调细胞中Akt活性,当采用P6或Siltuximab阻断IL-6/JAK2/STAT3信号时,上述效应被部分逆转.结论 A549细胞中,NOX4过表达能提高IL-6的自分泌水平,IL-6/JAK/STAT3信号参与介导NOX4促进A549细胞侵袭的效应.阻断这两个信号通路可能是针对NSCLC侵袭转移的一个潜在治疗手段.     

KL1在人非小细胞肺癌A549细胞中的作用及其相关机制研究

目的:研究人非小细胞肺癌A549细胞中Klotho基因表达的KL1蛋白的相关功能及其机制?方法:分别用表达KL1蛋白和表达KL蛋白(Klotho基因表达的另一种同源蛋白)的质粒转染非小细胞肺癌细胞株A549后,通过Western blot验证转染结果;MTT法检测细胞的生长情况;平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞转染后对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)信号通路的中下游靶位点蛋白ERK1/2磷酸化水平的影响?结果:转染48 h后细胞显著表达外源性KL(P < 0.01)?KL1蛋白(P < 0.01)?KL1基因过表达后可以抑制A549细胞生长(P < 0.01);同时显著抑制细胞增殖(P < 0.01),促进细胞凋亡(P < 0.01);KL1过表达能够明显降低bFGF通路中ERK1/2的磷酸化水平(P < 0.01);过表达KL1与过表达KL比较,两者在影响细胞生长?增殖?凋亡和对bFGF信号通路的激活中并无明显统计学差异(P > 0.05)?结论:KL1与KL蛋白均能够抑制肿瘤细胞生长增殖,促进肿瘤细胞凋亡,作用效果相当?KL1能够抑制bFGF信号转导通路,可能是KL中发挥抑制肿瘤作用的主要功能片段?     

熊果酸对脂多糖作用下肺上皮细胞炎症因子表达的影响及机制研究

目的:熊果酸(ursolic acid,UA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下人肺上皮细胞来源的A549细胞的生物学活性影响及潜在机制.方法:CCK-8检测不同浓度(10、50、100、150、200 μg/mL)UA对A549细胞增殖的影响.此外,检测浓度为10 μg/mL的UA作用于A549细胞不同时间点对细胞的增殖影响.荧光定量PCR检测UA对LPS作用下A549细胞的白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的mRNA表达.ELISA检测ERK、p38、JNK抑制剂对UA对LPS作用下A549细胞的IL-1β表达的影响,结果采用单因素方差分析.结果:UA能够显著抑制A549细胞的活性且呈浓度依赖性.CCK-8检测结果显示,UA作用A549细胞24h后,10 μg/mL的UA能够明显抑制A549细胞的活性(P＜0.05).此外,UA能够明显抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达(P＜0.05).其中,对LPS诱导的IL-1β抑制作用最为明显.ELISA结果显示,ERK、JNK信号通路抑制剂作用下并不能影响UA抑制炎症的效果,但p38信号通路抑制剂能显著逆转UA对LPS诱导的IL-1β的抑制作用(P＜0.05).p38信号通路的激活剂却可以逆转这种抑制作用(P＜0.05).结论:UA能够抑制LPS诱导的IL-1β,且通过p38信号通路作用.     

新藤黄酸与细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059 联合应用对肺腺癌A549细胞生长的影响

目的 研究新藤黄酸(Gambogenic acid,GNA)与细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)特异性抑制剂PD98059联合应用对肺腺癌A549细胞生长的影响.方法 新藤黄酸与ERK特异性抑制剂PD98059处理肺腺癌A549细胞,倒置显微镜观察细胞形态变化;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞内活性氧的变化;蛋白印迹法(Western blot)检测ERK、p-ERK蛋白的表达.结果 MTT法结果表明GNA在2.5 μmol/L对肺腺癌A549细胞的增殖有抑制作用;与PD98059合用24 h,GNA的抑制作用更加明显.倒置显微镜观察显示GNA作用肺腺癌A549细胞24 h后,细胞固缩变圆,体积变小,部分细胞呈半贴壁状态;GNA和抑制剂PD98059合用后,多数细胞固缩变圆,脱落,并悬浮于培养液中;少数细胞体积增大、肿胀、破裂呈坏死状.流式细胞仪检测结果表明,20 μmol/L PD98059 + 2.5 μmol/L GNA共同作用于A549细胞24 h后,与GNA 2.5 μmol/L组比较细胞内活性氧生成增加.Western blot法检测表明,PD98059和GNA联合作用A549细胞24 h后,p-ERK蛋白表达与GNA组比较显著降低.结论 GNA能诱导肺腺癌A549细胞凋亡,联合应用ERK抑制剂PD98059后可减少ERK蛋白的活化,增加肺腺癌A549细胞的凋亡;结果初步表明GNA诱导肺腺癌A549细胞的凋亡可能与调节ERK信号通路有关.     

U0126 在 A549 肺腺癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨 ERK 信号通路抑制剂 U0126 与 A549 肺腺癌细胞凋亡的关系。 方法:选用不同浓度的 ERK 信号通路抑制剂 U0126(10滋MU0126、20滋MU0126 和 40滋MU0126)作用于 A549 细胞,采用流式细胞术和 TUNEL 原位末端标记法检测细胞的凋亡情况。 结果:U0126 阻断 ERK 信号通路后,细胞凋亡率明显增加,各实 验组明显高于对照组(P<0. 01),但20滋M U0126 组与40滋M U0126 组间无明显差异(P>0郾 05)。 结论:ERK 信号 传导通路与 A549 肺腺癌细胞的凋亡有关,但 A549 肺腺癌细胞凋亡是受多因素的调控。     

IL-17A在非小细胞肺癌组织中的表达及其通过NF-κB信号通路对VEGF表达的调控作用

目的:探讨白细胞介素17A (IL-17A)在非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展中的作用及其通过核转录因子κB (NF-κB)信号通路对血管内皮生长因子(VEGF)的调控作用,阐明其相关机制。方法:收集NSCLC术后石蜡标本55例,免疫组织化学染色法检测正常肺组织和NSCLC组织中IL-17A和CD31的表达,分析IL-17A阳性表达率与NSCLC患者临床病理参数的关系,Pearson相关分析法分析IL-17A表达与CD31标记的微血管密度(MVD)的相关性。选取对数生长期的人肺腺癌A549细胞,将A549细胞分为对照组(A549细胞)、外源性重组人IL-17A (rhIL-17A)组、BAY11-7082组(NF-κB信号通路抑制剂)和联合组(rhIL-17A+BAY11-7082),Western blotting法检测各组A549细胞中IL-17受体A (IL-17RA)、P65、磷酸化P65 (p-P65)和VEGF蛋白表达水平,MTT法检测各组A549细胞培养上清液作用人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 48 h后各组细胞增殖活性。结果:NSCLC组织中IL-17A阳性表达率明...     

斑蝥素通过MAPK途径对肺癌A549细胞周期阻滞及其分子机制的研究

目的：探讨斑蝥素对人肺癌A549细胞的周期阻滞作用及其分子机制。方法：采用MTT法检测斑蝥素对A549细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测细胞周期；以蛋白印迹法分析斑蝥素作用后细胞周期蛋白B1（cyelinB1）、p34^cdc2、phos-p34^cdc2、p21、survivin、ERK1／ERK2、phos-ERK1／phos-ERK2等蛋白表达或活性的改变。结果：斑蝥素能抑制A549细胞的增殖；斑蝥素作用于A549细胞后引起G2／M期阻滞；斑螯素处理后，p34^cdc2、phos-p34^cdc2。表达量没有改变，cyclinB1、survivin蛋白表达量减少，p21蛋白表达量增加。ERK1／ERK2、phos-ERK1／phos-ERK2表达量降低。结论：斑蝥素通过调节cyclinB1、p21、survivin、ERK1／ERK2、phos-ERK1／phos-ERK2等蛋白表达或活性的改变引起G2／M期阻滞。     

丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移及ERK1/2磷酸化水平的影响

目的?研究丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移以及ERK1/2磷酸化水平的影响。方法?采用细胞划痕实验和高内涵细胞成像系统分析丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞迁移的影响;应用实时细胞传感电阻仪Transwell实验动态检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭的影响;通过纳米级超微量蛋白质分析系统检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果?丹参-人参组分配伍可显著增加划痕空白区域的距离（P<0.01）,且呈一定的时间依赖性;显著降低细胞迁移的面积（P<0.01）,且呈一定的剂量依赖性;对A549细胞侵袭有抑制作用（P<0.01）,且呈一定的时间依赖性;能够显著降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平（P<0.01）。结论?丹参-人参组分配伍能显著降低肺癌A549细胞迁移侵袭的能力,其作用机制可能与降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平有关。      

曲古抑菌素A对人肺腺癌细胞A549的生长抑制作用

目的 评价组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对肺腺癌细胞株A549的生长抑制作用.方法 分别以体外药物敏感实验、流式细胞术观察TSA处理肺腺癌细胞株A549后,其生长抑制情况以及细胞周期、细胞凋亡等指标的变化,Western blot检测p21及细胞外信号调节激酶(ERK)表达水平的变化.结果 TSA对肺腺癌细胞株A549具有生长抑制作用,其细胞毒性呈时间依赖性和浓度依赖性;TSA作用48及96h后,A549细胞凋亡、G0/G1期及G2/M期细胞显著增加(P<0.05);S期细胞显著下降(P<0.05).p21蛋白表达显著增强,磷酸化ERK蛋白表达显著下降.结论 HDAC抑制剂TSA对肺腺癌细胞株A549具有生长抑制作用,其机制可能是上调p21蛋白的表达,阻断ERK通路的活化,从而引起细胞周期的阻滞和细胞凋亡.     

非小细胞肺癌中EPHB6基因突变的筛选和功能预测

目的 筛查非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中EPHB6的体突变位点,并对突变的功能进行预测.方法 提取80例NSCLC患者肿瘤标本和3种NSCLC细胞系的基因组DNA,对EPHB6基因的整个编码区测序,所得结果与Genebank数据库比对,筛查得到EPHB6的突变位点.采用SIFT与Polyphen-2软件对目前所有已知的EPHB6体突变位点进行生物信息学预测. 结果 在80例NSCLC患者标本中发现3种新的EPHB6体突变位点（3例）,即R52C、Q498H和915-917del各1例,突变发生率为3.8％.生物信息学预测结果为包括R52C在内的多种EPHB6突变可能损害EPHB6的功能.结论 NSCLC中频发EPHB6突变,这可能与肿瘤的发生与发展密切相关,但需要进一步的功能性研究来证实.     

EPHB6受体型酪氨酸蛋白激酶抑制非小细胞肺癌转移的实验研究△

目的:探讨EPHB6对非小细胞癌(NSCLC)转移的抑制作用。方法:采用体外的黏附和迁移实验以及小鼠体内转移模型来评价EPHB6在NSCLC转移中的作用。过表达和RNAi干涉技术用于对EPHB6生物学功能的分析。结果:恢复EPHB6在肺腺癌细胞中的表达可增强细胞的黏附能力、降低细胞迁移能力。在患肺癌的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中,EPHB6的重新表达对肿瘤转移有明显抑制作用。结论:EPHB6在非小细胞肺癌中是一种肿瘤转移抑制基因。     

木犀草素抑制人肺腺癌A549细胞株的运动及其机制研究

目的:研究木犀草素(luteolin)对人肺腺癌A549细胞株运动的影响,并探讨其作用的相关机制。方法:MTT法检测木犀草素对人肺腺癌A549细胞株细胞活力的影响;伤口愈合实验观察木犀草素对A549细胞运动的影响;蛋白水平检测局部黏着斑激酶(FAK)及其磷酸化FAK的表达变化。结果:木犀草素作用于A549细胞后,呈剂量依赖性抑制A549细胞的增殖,IC50约为54.4μmol·L-1;木犀草素在15μmol·L-1剂量下,24 h和48 h后显著抑制A549细胞向损伤区域的迁移能力;蛋白水平检测发现木犀草素剂量依赖性地降低FAK磷酸化的水平,此外,FAK总蛋白的含量也有所下降。结论:木犀草素在对细胞生长无显著抑制效应的剂量下,通过作用于FAK这一关键分子抑制肿瘤细胞的运动。     

6-OHDA Induces Cycle Reentry and Apoetosis of PC12 Cells through Activation of ERK1/2 Signaling Pathway

This study investigated the effect and mechanism of cell cycle reentry induced by 6-hydrodopamine (6-OHDA) in PCI2 cells.By using neural differentiated PCI2 cells treated with 6-OHDA,the apoptosis model of dopaminergic neurons was established.Cell viability was measured by MTT.Cell apoptosis and the distribution of cell cycle were assessed by flow cytometry.Western blot was used to detect the activation of extracellular regulator kinasel/2 (ERK1/2) pathway and the phosphorylation of retinoblastoma protein (RB).Our results showed that after PC12 cells were treated wtih 6-OHDA,the viability of PC12 cells was declined in a concentration-dependent manner.Flow cytometry revealed that 6-OHDA could increase the apoptosis ratio of PC12 cells in a time-dependent manner.The percentage of cells in G0/G1 phase of cell cycle was decreased and that in S phase and G2/M phase increased.Simultaneously,ERK1/2 pathway was activated and phos- phorylated RB increased.It was concluded that 6-OHDA could induce cell cycle reentry of dopa-minergic neurons through the activation of ERK1/2 pathway and RB phosphorylation.The aberrant cell cycle reentry contributes to the apoptosis of dopaminergic neurons.