互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的：探讨互隔交链孢酚（Alternariol,AOH）对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法：20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果：与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加（P〈0.05）;用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论：AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.     

鞣酸对人食管癌细胞系EC9706的抑制作用

目的 探讨鞣酸对体外培养的人食管癌细胞EC9706的生长抑制作用。方法 不同浓度鞣酸（100、200、300、400、500μmol／L）作用EC9706细胞24、48、72、96h后，通过MTT比色法研究鞣酸对EC9706细胞增殖的影响，采用流式细胞仪观察400μmol／L鞣酸能否诱导EC9706细胞凋亡。^3HTdR、^3HLeucine掺入法研究400μmol／L鞣酸对食管癌细胞DNA复制及蛋白合成的影响。结果 鞣酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC9706细胞增殖；流式细胞术检测显示出典型的凋亡峰，细胞凋亡率为46．8％；^3H—TdR、^3H—Leucine掺入量明显减少。结论 鞣酸可以抑制食管癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，可能是预防和治疗食管癌的一种新型化合物。     

ROCK抑制剂对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响

目的研究ROCK特异性抑制剂Y-27632对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响,并探讨其可能的机制。方法体外培养人食管癌株EC9706,加入20μmoL／L的Y-27632溶液（实验组）及等体积的PBS（对照组）培养1h,采用细胞计数、MTF实验检测细胞生长情况,采用Transwell实验观察细胞迁移情况,采用Westernblot检测Cav-1的表达水平,并进行两组的比较。结果细胞计数、MTT、Transwell实验结果显示,Y-27632可以抑制细胞的生长与迁移能力,与对照组比较差异有统计学意义（P均〈0．05）。Westernblot检测结果显示,Y-27632处理细胞1h后,Cav-1蛋白表达水平明显下降,并明显低于对照组（P均〈0．05）。结论ROCK信号通路参与EC9706细胞生长与迁移的调节,Y-27632可以抑制EC9706细胞的生长及迁移能力,其机制可能与下调Cav-1的表达有关。     

靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞12、24和48h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;用10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞0、24、48和72h后,采用流式细胞术法检测凋亡率;分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞48h后,采用RT-PCR法检测细胞Sox-2mRNA的表达。结果:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖具有明显的抑制作用,且表现为剂量依赖性和时间依赖性(F剂量=135.237,F时间=96.488,F交互=189.544,P均<0.001)。靛玉红甲肟作用EC9706细胞后,细胞凋亡率呈时间依赖性上升(F=195.350,P<0.001),Sox-2mRNA的表达呈剂量依赖性下调(F=87.552,P<0.001)。结论:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与下调Sox-2mRNA表达有关。     

TSA对食管癌细胞系EC9706细胞周期作用及分子机制的探讨

目的 研究去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)对食管癌细胞 EC9706细胞周期的作用及机制.方法 将浓度为0.5、1.0、1.5 μmol/L TSA作用EC9706细胞24 h,用MTT观察不同浓度 TSA 对 EC9706细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测细胞生长及周期;Western Blot检测TSA对食管癌细胞周期相关基因的表达.结果 1.0 μmol/L 浓度的TSA 对EC9706 细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系,在1.0 μmol/L浓度之上可明显诱导食管癌细胞EC9706细胞周期阻滞,明显增强p21、p27基因的表达,明显降低 CCND1、CDK4D基因的表达.结论 一定剂量的TSA可抑制食管癌EC9706细胞的生长,通过调控多个细胞周期相关基因诱导食管癌细胞细胞周期阻滞,细胞阻滞的发生与p21、p27基因表达的增加及CCND1、CDK4D基因表达的减少相关.     

癌胚抗原表达对E1B缺失型腺病毒H101抗癌作用的影响

目的:研究调控食管癌CEA基因表达对E1B缺失型腺病毒H101抗癌作用的影响,探讨影响H101敏感性的内在因素.方法:选择CEA低表达的EC9706细胞株（EC9706-SCEA）和CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA)复苏培养,细胞生长实验检测调控食管癌EC9706 CEA基因表达对细胞生长的影响,...     

PTEN反义寡核苷酸对EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响

目的:探讨PTEN反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响.方法:利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN和无义寡核苷酸(N-ODN)转染食管癌EC9706细胞,终浓度为3、6和12μmol/L的ASODN为实验组,终浓度12 μmol/L的N-ODN为N-ODN对照组,不进行转染的为空白对照组.运用MTT法、TUNEL检测空白对照组、N-ODN对照组及3种浓度的ASODN作用24、48及72 h后食管癌EC9706细胞增殖和凋亡情况;采用免疫细胞化学技术及原位杂交方法检测各组EC9706细胞中PTEN蛋白、mTOR蛋白和mRNA的表达.结果:①随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=784.774,F6μmol/L=242.884,F12μmol/L=412.105,P均＜0.001)和时间(F24 h=60.676,F48 b=57.703,F72 h=51.841,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的增殖增强.②随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=36.655,F6μ=mol/L47.594,F12μmol/L=85.264,P均＜0.001)和时间(F24h=4.860,F48 h=4.901,F72 h=8.153,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的凋亡下降.③随PTENASODN转染浓度(F3μmol/L=45.634,F6μmol/L=66.399,F12μmol/L=72.763,P均＜0.001)和时间(F24h=4.065,F48 h=3.985,F72 h=5.446,P＜0.001)的增加,PTEN的蛋白表达降低;mRNA的表达也降低(F3μmol/L=23.357,F6μmol/L=43.272,F12μmol/L=51.402,P均＜0.001;F24h=3.933,F48 h=4.084,F72 h:4.528,P＜0.001).④mTOR蛋白(F3μmol/L=19.422,F6 μmol/L=30.000,F12 μmol/L=62.168,P＜0.001;F24 h=5.340,F48 h=9.150,F72 h=21.056,P＜0.001)和mRNA(F3μmol/L=19.414,F6 μmol/L=46.571,F12μmol/L=68.634,P＜0.001;F24 h=4.815,F48 h=12.165,F72 h=7.858,P＜0.001)的表达随PTEN ASODN转染浓度和时问的增加而增强.⑤上述各指标中均以12 μmol/LASODN作用72 h的效应最强(P均＜0.05).结论:PTEN ASODN促进食管癌EC9706细胞增殖、抑制凋亡,下调PTEN蛋白和mRNA的表达,上调mTOR蛋白和mRNA的表达.     

抑制Raf-MEK-ERK信号传导途径上调食管癌细胞株EC9706柯萨奇-腺病毒受体的表达

目的 研究Raf-MEK-ERK信号传导途径对食管癌EC9706细胞柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达的影响.方法 用ERK抑制剂PD98059 10、20、40 μmol/L作用EC9706细胞24 h,利用免疫荧光和RT-PCR、Western-blot检测各种浓度处理前、后CAR表达水平的变化.结果 与对照组比较,10 μmol/L PD98059组CAR表达水平差异无统计学意义;20、40 μmol/L PD98059处理组 CAR表达水平显著提高(P<0.05),且呈浓度依赖性.结论 用一定浓度的抑制剂抑制Raf-MEK-ERK信号传导途径可上调食管癌EC9706细胞膜表面CAR的表达.     

癌胚抗原基因抑制对溶瘤腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤的影响

目的:观察癌胚抗原(CEA)特异性基因沉默对溶瘤腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素.方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEAsiRNA载体,通过基因转染,在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,用H101进行瘤内注射.采用Real Time PC和Western Blot方法检测移植瘤组织中CEA的表达,测量肿瘤体积.结果:降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和体积无影响,经H101瘤内注射治疗后,干扰组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为(50.16±19.01)、(208.13±72.29)、(219.46±46.56)mm3,干扰组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而空载体组与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05).论:抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达,可引起H101敏感性增加.     

TGF-β 通过Lnc-ATB 促进食管癌细胞 侵袭转移的机制研究

目的 探讨转化生长因子-β（TGF-β）对食管癌细胞侵袭转移的影响及其作用机制。 方法 将食管癌细胞加入TGF-β 后,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测食管癌细胞EC9706 中被TGF-β 活化的长链非编码RNA（Lnc-ATB）的表达情况,通过Transwell 实验检测TGF-β 对EC9706 细胞侵袭转移的 影响;沉默EC9706 细胞中Lnc-ATB 的表达,给予或不给予TGF-β 刺激,利用Transwell 实验检测EC9706 细 胞侵袭转移的情况。结果 Lnc-ATB-siRNA 组Lnc-ATB 较Lnc-ATB-NC 组低（P <0.05）,Lnc-ATB siRNA 可有效沉默EC9706 细胞中Lnc-ATB 的表达。TGF-β 组TGF-β 处理后EC9706 细胞的侵袭和转移细胞数均 高于对照组（P <0.05）。TGF-β+Lnc-ATB-NC 组TGF-β 通过Lnc-ATB 上调EC9706 细胞侵袭及转移能力 高于其他组（P <0.05）;空白组细胞侵袭能力高于TGF-β+Lnc-ATB-siRNA 组和Lnc-ATB-siRNA 组（P <0.05）。 结论 食管癌中TGF-β 通过上调Lnc-ATB 的表达,促进细胞的侵袭及转移。     

姜黄素对食管癌EC-9706细胞增殖的影响

目的观察姜黄素对人食管癌EC-9706细胞增殖的影响并探讨其分子机制。方法应用50～200txmol／L姜黄素处理食管癌EC-9706细胞株12—48h后,应用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测细胞增殖抑制率、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测热休克蛋白70（Hsrv0）mRNA的表达。结果经姜黄素干预后,人食管癌EC一9706细胞生长减慢,MTT法检测结果显示增殖抑制率达18．3％～77．5％（P〈0．05）,呈良好的时间一剂量效应关系,HSP70mRNA的表达下调。结论姜黄素能够有效抑制人食管癌细胞EC-9706的增殖．其机制可能与抑制HSP70mRNA的表达有关。     

血红素加氧酶-1基因在三氧化二砷诱导食管癌EC9706细胞凋亡过程中的表达

目的:检测三氧化二砷(As2O3)诱导食管癌EC9706细胞凋亡过程中血红素加氧酶-1(HO-1)基因的表达,探讨HO-1的表达与化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的内在联系。方法:以食管癌EC9706细胞系作为研究模型,3μmol/L AS2O3作用于EC9706细胞,镜下观察细胞形态变化;MTT法绘制细胞生长曲线;以RT-PCR方法检测HO-1mRNA的表达。结果:As2O3作用于EC9706细胞4 h即可检测到HO-1基因表达升高,12 h表达水平升至最高,24 h回落到正常水平。结论:As203诱导EC9706细胞凋亡过程中,HO-1基因表达升高,呈时间依赖性变化,可能起到短暂的对抗氧化应激作用。     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌EC9706细胞肝素酶基因表达的影响

目的:探讨RNAi技术对人食管癌EC9706细胞肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达的影响.方法:针对Hpa不同基因位点设计合成寡核苷酸,然后转录为小分子干扰RNA(siRNA),分别用浓度为10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体介导转染EC9706细胞72 h,同时设无关序列组及不转染组.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中Hpa基因的表达.结果:siRNA可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达,以15 μmol/L的siRNA作用效应最强,但不同浓度siRNA两两相比,差异均无统计学意义(P＞0.05),不同浓度siRNA对Hpa基因表达的抑制效应均显著强于无关序列组及不转染组(P＜0.05).结论:RNAi技术可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达.     

小白菊内酯诱导人食管癌细胞凋亡的研究

目的 探讨小白菊内酯(Parthenolide,PN)对人食管癌细胞EC9706增殖和凋亡的影响及PN的作用机制.方法 MTT法检测PN(20、40和80μmoL/L)作用EC 970624、48和72 h细胞增殖活性的变化;流式细胞术和免疫细胞化学法分别检测PN处理的EC9706细胞凋亡和NF-K Bp65蛋白表达的变化.结果 ①PN抑制EC 9706的增殖活性,呈时间和剂量依赖性.②PN作用EC 970648 h后,NF-κ Bp65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05).③PN作用EC 970672h后,细胞早期和晚期凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PN抑制EC9706细胞的增殖,诱导其凋亡,作用机制与抑制NF-κB有关.     

小白菊内酯对EC9706细胞增殖及VEGF、NF-κB P65蛋白表达的影响

目的:探讨小白菊内酯(PTL)对食管癌EC9706细胞的增殖、血管内皮生长因子(VEGF)及核转录因子-κB P65(NF-κB P65)蛋白表达的影响.方法:倒置显微镜下观察不同浓度(20、40和80 μmol/L)的PTL作用48 h后EC9706细胞的形态学变化;MTT法检测20、40和80 μmol/L PTL及20 μmol/L PTL与25 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)联用对EC9706细胞增殖的影响;免疫细胞化学法检测20和40 μmol/L的PTL作用72 h后EC9706细胞VEGF和NF-κB P65蛋白表达的改变.结果:①PTL作用EC9706细胞48 h后,细胞数量减少,细胞固缩变圆,核浓缩、核质分布不清,细胞溶解碎裂.②PTL及联合组作用于EC9706细胞24、48和72 h后,相同时间段各组细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(χ224 h=31.420,P<0.001;χ248 h=34.590,P<0.001;χ272 h=38.190,P<0.001).PTL对EC9706细胞的增殖有抑制作用;细胞培养72 h后PTL与5-FU联合组对EC9706细胞的抑制作用与50 mg/L 5-FU组相当.③PTL作用EC9706细胞后,与对照组比较VEGF和NF-κB P65蛋白表达均降低(χ2NF-κB P65=25.120,P<0.001;χ2VEGF=22.190,P<0.001).结论:PTL能抑制EC9706细胞的增殖,增加EC9706对5-Fu的敏感性;PTL的抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB传导通路有关.     

食管癌放射抗拒细胞P-gp和GST-π表达的研究

目的研究食管癌放射抗拒细胞多药耐药基因的表达。方法以食管癌EC9706细胞为研究对象,采用长期、间隔、γ射线照射的方法建立放射抗拒的食管癌EC9706细胞系EC9706-R,MTT法测定EC9706-R的耐药指数,免疫细胞化学法和RT-PCR法分别测定P-gp、GST-π的蛋白和mRNA的表达。结果EC9706-R细胞耐药指数是EC9706细胞的1.24倍,P-gp和GST-π的蛋白均有表达,mRNA表达比EC9706细胞高。结论诱导建立的食管癌放射抗拒细胞EC9706-R的化疗耐药性有所增高,原因多为放疗增加了P-gp和GST-π的表达。     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

过氧化氢对胰岛微血管内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2表达的影响

目的：研究过氧化氛（H2O2）对胰岛内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2（iPLA2）mRNA表达的影响。方法：用0,30,100和300μmol／L H2O2诱导IMECs8h后进行RT-PCR检测;用300μmol／L H2O2分别诱导0,4,8和12h后应用RT-PCR技术进行iPLA2基因表达的检测。采用Annexin V-FITC／PI双染色检测细胞的凋亡率;采用DIOC6（3）染色检测细胞线粒体膜电位.结果：①300μmol／L H2O2作用12h的电泳条带亮度与其他组（0,30,100μmol／L）相比明显减弱,300μmol／L H2O2作用8h及12h的电泳条带亮度与0,4h相比明显减弱。②各浓度H2O2处理组（0,30,100和300μmol／L）IMECs凋亡率差异具有统计学意义[分别为（2.0±0.5）％,（19.1±5.8）％,（28.4±4.9）％,（40.1±5.1）％,P〈0.01];300μmol／L H2O2处理0,4,8,12h后,各时间点IMECs凋亡率差异具有统计学意义（P〈0.01）;③各浓度及各时间点H2O2处理组IMECs细胞内DIOC6（3）的荧光强度差异具有统计学意义（P〈0.01）.结论：H2O2对IMECs iPLA2的表达具有抑制作用,其抑制作用呈量效及时效关系。     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。