RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响。方法构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(pshRNA-hTERT)并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点。结果转染乳腺癌细胞后,pshRNA-hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2%;蛋白表达分别下调46.6%,47.8%。端粒酶活性均明显下降。对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加。结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

目的 通过构建CXCR7短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的真核表达载体,探讨趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖、凋亡、周期的影响.方法 针对CXCR7构建编码shRNA序列的重组表达载体;分别用RT-PCR和Western blot检测CXCR7 mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期.结果 构建针对CXCR7短发夹状RNA序列的表达载体,经酶切及测序证实与设计完全一致;将2个CXCR7shRNA载体(CXCR7-shRNA1;CXCR7-shRNA2)转染MDA-MB-435s细胞后,CXCR7 mRNA及蛋白平均降低;抑制CXCR7的表达后,CXCR7-shRNA组细胞增殖率明显下降(P＜0.05),细胞凋亡增多(P＜0.05),细胞周期无明显改变.结论 重组表达载体CXCR7-shRNA1、CXCR7-shRNA2能有效抑制靶基因CXCR7的表达,进而可抑制人乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,促进细胞凋亡,而对细胞周期无明显影响.     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bmi-1基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖和侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建针对Bmi-1基因shRNA序列的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1,转染AGS细胞,采用Western blot检测重组质粒对Bmi-1蛋白表达的影响,MTT法检测重组质粒对AGS细胞体外生长的抑制作用,PI单染法流式细胞术检测转染重组质粒后细胞凋亡与细胞周期的变化,小室侵袭实验检测AGS细胞侵袭能力变化。结果:成功构建了vshRNA-Bmi-1重组质粒,并成功转染AGS细胞抑制Bmi-1蛋白的表达。转染重组质粒后,AGS细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加,S期比例上升,细胞侵袭能力弱于非特异性转染组。结论:vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1蛋白在AGS胃癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭,促进其凋亡。     

shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞 MCF-7侵袭能力的影响及机制研究

目的：探讨shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及机制。方法：以人乳腺癌细胞系MCF-7细胞为实验对象。按照处理方法将乳腺癌MCF-7细胞分成3组,即空白对照组(不转染慢病毒的乳腺癌MCF-7细胞组)、阴性对照组(乳腺癌MCF-7细胞转染无序序列慢病毒载体)和shRNA干扰组(乳腺癌MCF-7细胞转染shRNA SIRT3序列慢病毒载体)。采用实时荧光定量PCR和Western blotting等方法检测SIRT3和凋亡相关因子caspase-3、caspase-9的表达水平;采用Transwell试剂盒检测细胞的侵袭能力。结果：shRNA干扰组SIRT3 mRNA相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。Western-blotting检测结果显示,shRNA干扰组SIRT3蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<...     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因的 shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计、合成2对针对SIRT1基因shRNA的寡核苷酸序列,与pLentilox3.7-GFP载体连接产生重组慢病毒质粒pshSIRT1-1、pshSIRT1-2,同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pshCont。将表达shRNA的载体plentilox3.7与pLP1、pLP2和pLP/VSVG 3种质粒共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7,行real time-PCR和Western blot验证SIRT1基因的沉默效果,台盼蓝排斥实验和流式细胞仪分别检测其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建靶向SIRT1基因shRNA慢病毒载体并获得了相应的慢病毒。2个靶向 SIRT1的shRNA均能有效抑制SIRT1基因的表达（P=0.000 2）,并使MCF-7细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加（P=0.006 0）。结论：靶向SIRT1基因RNA干扰能显著抑制 MCF-7 细胞的生长并促进其凋亡。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67 RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株Ki-67 mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默Ki-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向Ki-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染Ki-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果 Ki-67siRNA载体转染24h后可显著抑制乳腺癌MCF-7/ADR细胞株的Ki-67 mRNA、蛋白表达及增殖活性。Ki-67 siRNA组阿霉素IC₅₀值为（6.3±0.9）μg/ml。结论 Si-Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力。沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的：构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA（MDR1）,并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法：根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。 用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Western blotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果：重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60 bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDR mRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论：逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。     

缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7中的抗凋亡作用

目的研究缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中对凋亡的作用。方法氯化钴（COCl2）模拟低氧环境。采用RNA干扰技术,构建针对HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞。Real-timePCR和Western-blot技术分别检测HIF-1αmRNA和蛋白质水平。Sub-G1测定,AnnexinV荧光标记和DNAladder检测细胞凋亡。结果缺氧后MCF-7细胞HIF-1α的蛋白质水平表达增加,但缺氧后细胞的凋亡率比正常氧水平时低。实时定量PCR和Westernblot结果证实转染短发夹RNA后,MCF-7细胞中HIF-1α基因表达被成功抑制。阿糖胞苷诱导或无凋亡诱导剂时,干扰组凋亡率比未转染组明显增高。结论这项研究证明HIF-1在MCF-7中发挥抗细胞凋亡的作用,为针对HIF-1α的shRNA有效地用于乳腺癌的治疗提供新的思路。     

葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的　构建葡萄糖糖基神经酰胺合成酶(GCS)小干扰RNA表达载体,观察其对乳腺癌耐药细胞(MCF- 7 /ADR)GCS基因表达和耐药性的影响。方法　设计合成2对GCS基因的特异性siRNA,分别定向克隆入真核表达载体pSUPER,构建pSUPER -GCS1和pSUPER -GCS2重组质粒,脂质体LipofectAMINE2000介导转染MCF -7 /ADR细胞,空载体pSUPER转染作为对照,逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)分析GCSmRNA的表达,流式细胞仪观察GCS蛋白的表达,四氮唑盐法检测阿霉素对MCF -7 /ADR细胞的半数抑制浓度(IC50 ),流式细胞技术检测细胞凋亡率的改变。结果　酶切分析和测序证实成功构建了针对GCS的siRNA表达载体pSUPER -GCS1和pSUPER GCS2。两对重组质粒均可特异性抑制GCS基因表达,转染后48hGCSmRNA抑制率分别为89 .4%、88. 5%,GCS蛋白含量分别下降为8 .3%±1 .0%, 9. 2%±0 .8%,四氮唑盐法显示重组质粒对阿霉素耐药性相对逆转率分别为93. 7%、91. 6%,明显提高了乳腺癌细胞对于阿霉素的药物敏感性,流式细胞仪结果表明细胞凋亡率增加为15. 38±1 .16, 13. 92±1 .73,而空载体对照组无以上作用。结论　GCS特异性siRNA表达载体构建成功,且有效抑制了GCS基因表达,并通过诱导耐药细胞凋亡率增加,逆转乳腺癌细胞多药耐药。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对人乳腺癌细胞功能的影响

目的研究靶向针对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的短发夹RNA(shRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞功能的影响。方法氯化钴模拟低氧环境。采用RNA干扰技术,构建针对HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞。RT-PCR检测RNA干扰后MCF-7中血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。实时定量PCR和Westernblot技术分别检测HIF-1αmRNA和蛋白质水平。Sub-G1测定、AnnexinⅤ荧光标记和DNAladder检测细胞凋亡。流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果缺氧后,MCF-7中的HIF-1α表达增加(P<0.01),而凋亡率较常氧降低(P<0.05)。shRNA转染MCF-7后,HIF-1α的表达下调91.63%(P<0.01)。阿糖胞苷诱导或无凋亡诱导剂时,干扰组凋亡率比未转染组分别增高1.75倍(P<0.01)和61.31倍(P<0.01)。与未转染组相比,干扰组中的VEGF下调66.8%(P<0.05)。干扰组细胞周期进程也较未转染组减缓。结论HIF-1α在MCF-7中发挥抗细胞凋亡的作用。本室构建的针对HIF-1α的shRNA能够促进MCF-7凋亡,下调VEGF表达,推迟细胞周期。     

shRNA沉默Bmi-1质粒构建及对鳞癌细胞ECA109增殖的影响

目的 研究shRNA沉默Bmi-1基因对鳞癌细胞ECA109增殖变化的影响,探讨Bmi-1基因在鳞癌细胞增殖中的作用。方法 采用RT-PCR和Western blot法分别检测Bmi-1在Fibroblast细胞、Hacat细胞、A431细胞、ECA109细胞中的表达。构建重组质粒GPU6/GFP/Neo-shBmi-1,脂质体转染ECA109细胞后,检测细胞中Bmi-1表达变化。MTT法检测转染前后细胞抑制率,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与Fibroblast细胞和Hacat细胞相比,Bmi-1在鳞癌细胞系A431、ECA109中含量明显升高。重组载体GPU6/GFP/Neo-shBmi-1构建成功,转染ECA109细胞后Bmi-1表达明显降低(P＜0.05)。与对照组相比,转染后细胞增殖明显受到抑制(P＜0.05);G1期细胞明显增加(P＜0.05),S期细胞明显减少(P＜0.05)。结论 Bmi-1与细胞恶性增殖相关。在ECA109细胞中沉默Bmi-1,可改变细胞周期,从而抑制细胞增殖。     

S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF7细胞生长的研究

目的探讨S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖及侵袭能力的抑制作用。方法用特异性沉默SAMDC基因表达的RNA干扰真核表达载体SAMDC shRNA表达载体(pGPU6 SAMDC)转染乳腺癌MCF 7细胞,采用RT PCR和Western blot技术分别检测SAMDC mRNA和蛋白质表达水平;细胞增殖实验（CCK 8法）和细胞周期分析评价SAMDC基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖的影响,肿瘤侵袭实验观察SAMDC基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7侵袭活性的影响。结果SAMDC shRNA表达载体转染后,MCF 7细胞SAMDC mRNA水平下调43.8％,蛋白表达水平下降66.5％;MCF 7细胞的增殖活性和侵袭能力均受到明显抑制,细胞增殖活性下降37%,细胞周期分析G1期细胞增加。结论SAMDC基因沉默可通过延长细胞周期的G1期而抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖,并能降低癌细胞侵袭活性,提示SAMDC可作为乳腺癌基因治疗的靶分子。     

短发夹RNA沉默S100A4对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平以及增殖水平和凋亡率的变化。经过脂质体介导将S100A4shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养,裸鼠体内成瘤试验检测各组细胞增殖情况。结果经测序鉴定证实成功构建S100A4-shRNA表达载体。所构建的S100A4-shRNA表达载体能够有效抑制MCF-7细胞中S100A4的表达,并且可以显著降低MCF-7细胞增殖水平以及诱导细胞进入晚期凋亡;稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,而实验组裸鼠肿瘤体积和重量明显小于空白对照组和阴性对照组。结论S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平。     

前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP的构建

目的：构建前列腺组织特异性表达载体。方法：利用基因重组技术将PSA基因上游5．8kb的调控序列克隆至真核表达载体pEGFP-1，构建前列腺组织特异性表达载体pPSA-EGFP；用脂质体Lipo-fectamine将载体pPSA-EGFP分别转染前列腺癌细胞株PC．3m、乳腺腺癌细胞株MCF-7、结肠腺癌细胞株HT-29、肝癌细胞株HepG2、宫颈癌细胞株HeLa和肺腺癌细胞株A549多种细胞，转染后48h荧光显微镜下观察GFP的表达情况，pPSA-EGFP和phAR共转染PC-3m细胞。结果：在pPSA-EGFP和phAR共转染的PC-3m细胞中绿色荧光蛋白表达明显，MCF-7细胞中绿色荧光蛋白表达微弱，其他细胞中荧光蛋白不表达。结论：构建的前列腺表达载体pPSA-EGFP具有组织特异性。     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

长链非编码RNA LINC00173在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中的作用

目的探讨长链非编码RNA LINC00173对紫杉醇耐药乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响,并探讨其可能的作用机制。方法利用qRT-PCR方法检测LINC00173在乳腺癌细胞株（MCF-7、MDA-MB-231和SKBR-3）和正常乳腺癌上皮细胞系（MCF-10A）的表达水平;构建LINC00173过表达载体和干扰片段,各自转染到乳腺癌细胞株中,利用qRT-PCR方法检测转染后LINC00173的表达水平;采用CCK8实验检测乳腺癌细胞的增殖能力;Transwell侵袭和划痕实验,检测细胞的侵袭和迁移能力;Western blotting方法检测CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白的表达。结果与MCF-10A细胞相比,LINC00173在乳腺癌细胞株中低表达;MCF-7细胞转染干扰片段及MCF-7/PR耐药细胞株转染过表达LINC00173载体后,与阴性对照（si-NC）组相比,si-LINC00173的表达降低;而与LV-NC组相比,过表达LV-LINC00173后的表达增加,且差异有统计学意义（P < 0.01）;干扰LINC00173的表达后,MCF-7细胞的增殖及迁移能力增强（P < 0.01）;过表达LINC00173后,MCF-7/PR细胞的增殖、侵袭及迁移能力减弱（P < 0.01）;干扰LINC00173后,MCF-7细胞CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白的表达水平明显增加（P < 0.01）;过表达LINC00173后,MCF-7/PR的CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白表达水平明显下降（P < 0.01）。结论LINC00173在乳腺癌细胞中表达降低并可能通过调控β-catenin表达参与紫杉醇耐药过程且与其发生、发展及侵袭有关,是涉及到乳腺癌发展的一种新的分子,可为临床诊断、治疗乳腺癌提供新的理论依据。