缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建

目的 构建缺失WN-7受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索。方法 采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7．5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ。将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-7受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒vIT△B8RLaeZ。结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确，核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VIT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定。VTTΔB8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当。兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力。结论 本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区，缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体。     

表达HPV 16型结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法 采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增并克隆HPV16主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2基因;将经过结构修饰的L1和L2基因插入痘苗病毒表达载体,通过与痘苗病毒在宿主细胞中同源重组后,筛选共表达L1／L2蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果 DNA序列分析证实PCR扩增所获L1和L2克隆基因是正确的;斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1和L2基因插入;该重组病毒在人源细胞中不复制或低水平复制,但可稳定表达相对分子质量为57000的L1蛋白和相对分子质量为90000的L2蛋白。结论 获得1株稳定表达HPV16 L1／L2蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。     

大鼠Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在神经前体细胞分化中的作用

目的 探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响. 方法从大鼠脑组织中提取总BNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因在转染细胞中的过表达情况. 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定,证实目的 基因已插入重组质粒,RT-PCR证明,经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因;实时荧光定量PCR进一步证明,转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA高表达. 结论 构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆.Hes1基因高表达可抑制神经前体细胞Ngn1的表达,并促进神经前体细胞向神经胶质细胞的分化.     

实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量PCR方法检测CaMKⅡα-Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法以CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象,利用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠的拷贝数,并筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果绝对定量标准曲线公式为:△Ct=-2.402log5N(拷贝数)+8.654,相关系数为0.9999,扩增效率为95.4%。三只CaMKⅡα-Cre首建鼠的拷贝数分别为19、7、5;三个转基因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛 …

目的 提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法 利用ＴＫ区表达狂犬病毒糖蛋白（ＲＧ）的重组痘苗病毒作为亲本株，通过两步同源重组，删除痘苗病毒基因组ＣＫ片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段，同时将狂犬病毒核蛋白（ＲＮ）基因插入Ｃ－Ｋ片段之间，获得了含有ＲＧ基因和ＲＮ基因的非复制型重组痘苗病毒ＶＴＫＲＧ△ＣＫＬａｃＺＲＮ。结果 经ＰＣＲ鉴定，ＲＮ基因已插入ＣＫ区；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示     

腺病毒重组疫苗载体构建的研究进展

腺病毒(Ad)基因组E_1、E_3、以及E_4区和右侧端插入性末端重复(ITR)之间的区段,均存在外源基因插入位点。本文论述了外源保护性免疫原基因插入Ad基因组上述不同位点构建各类重组疫苗载体的研究进展。     

狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立和阳性对照的制备

目的 建立狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法,制备狂犬病病毒(rabies virus,RV)的假病毒颗粒阳性对照.方法 在RV的N基因保守区设计引物和探针,建立反转录实时荧光定量PCR检测方法,克隆得到噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因(MS2),将其重组到质粒pET-28b(+)中,再将RV的N基因片段重组到MS2下游,经原核表达得到RV假病毒颗粒.结果 实时荧光定量PCR检测RV重组质粒最低检测限为15拷贝/μl,重组表达质粒经原核表达可形成耐RNase的RV病毒样颗粒.结论 建立了反转录实时荧光定量PCR检测RV核酸的方法,成功构建了可耐受RNase且无传染性的RV阳性对照.     

问号赖型钩体017株与七日热型钩体56610株内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析

目的通过不同型钩体DNA序列分析筛选钩体基因疫苗的候选株,并从基因水平解释钩体血清型的特异性.方法(1)酚、氯仿抽提法提取017株与56610株钩体基因组DNA.(2)分别以017株与56610株钩体基因组DNA为模板,PCR法扩增内鞭毛蛋白(flaB)基因.(3)T/A快速克隆法将两个flaB基因的PCR产物连接与Teasy-vector载体.(4)α-互补、PCR法初步筛选重组质粒.(5)碱裂解法小量提取质粒、酚切分析进一步鉴定重组质粒,确定外源基因插入方向.(6)双脱氧终止法对重组质粒的克隆化flaB基因进行测序.(7)应用软件对所测序列进行酶切位分析及编码蛋白的预测.(8)与已发表的钩体内鞭毛基因进行比较.结果经鉴定获得了两个重组质粒pDHTF017与pDHTF610.pDHTF017中flaB基因为反向插入,pDHTF610中的flaB基因为正向插入.两个重组外源flaB基因长度均为852bp,编码蛋白含283个氨基酸,预测分子量为31.5kD左右.两个基因的限制性内切酶位点相似,含多个常见酶切位点.几个血清型钩体的flaB基因比较发现型间同源性很高(90%-99%),变异通常发生在固定位点,各型选择不同的固定位点.结论(1)重组质粒pDHTF017与pDHTF610中的外源基因均为钩体的一种flaB基因;(2)flaB基因保守性强,可作为基因疫苗的靶基因;(3)七日热型钩体56610株的flaB基因有望成为核心抗原基因,可进行钩体疫苗的研究开发.     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛株中的共同表达

目的　提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法　利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白 (RG)的重组痘苗病毒作为亲本株 ,通过两步同源重组 ,删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段 ,同时将狂犬病毒核蛋白 (RN)基因插入C K片段之间 ,获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。结果　经PCR鉴定 ,RN基因已插入CK区 ;Westernblot结果显示 ,该株病毒能同时表达RG和RN ,相对分子质量 (Mr)分别为 6 5× 10 3 和 5 0 5× 10 3。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK 143细胞中不能正常繁殖 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比 ,VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体 ,效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组 ;它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株 (CVS)的攻击。结论　VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性