胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。 目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。 材料：成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。 方法：取兔颈后皮下脂肪,I型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞,以0.5×106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%~95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周。 主要观察指标：采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。 结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达。细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P < 0.05),G1期比例显著下降(P < 0.05)。 结论：质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。 目的：验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。 设计、时间及地点：两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。 对象：6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。 方法：扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5 组：①未转染组：仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组：双无L-DMEM +pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组：双无L-DMEM+pcDNA3.1- SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。 主要观察指标：对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。 结果：MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0 01)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。 结论：双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景：以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养，诱导方式主要集中于细胞因子的方法，而椎间盘体内微环境，除细胞因子对细胞影响外，在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究。 目的：在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导，观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异。 方法：分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞，脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后，按5×106个细胞制成微球，置于Transwell培养板中培养，分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导；于诱导前、诱导7，14 d，观察细胞形态变化，并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定。 结果与结论：在体外诱导7，14 d，两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别。RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达，但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强；诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高，优于转化生长因子 β1/胰岛素样生长因子1组。结果表明，在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子，说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外，尚存在相互促进增殖分化作用。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用☆

背景：近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相互作用的报道。 目的：观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用。 方法：获取脂肪来源间充质干细胞,以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的表达。 结果与结论：加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示胰岛素样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义。提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性☆

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。 目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。 结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力*

背景：基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少。 目的：观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响。 方法：贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率。骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组。在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%。缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05)。缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05)。提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。 目的：验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。 方法：对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为2组：实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组。3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色。将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架，分为4组培养：复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组，1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组，且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示，Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架；模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组。结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖，有利于细胞之间的信号传递，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境；作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

重组pEGFP-N1-IGF-1质粒体内转染骨质疏松大鼠的可行性

背景：胰岛素样生长因子1水平的下降与骨质疏松密切相关,目前应用基因技术是骨质疏松等骨代谢疾病治疗的发展方向,但病毒载体可能引起严重免疫反应,质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1活体转染骨质疏松大鼠可能成为一种有效的治疗手段。 目的：观察质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1转染骨质疏松大鼠中胰岛素样生长因子1的表达。 方法：雌性SD大鼠随机分为假手术组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组。后2组予双侧卵巢切除。术后12周,3组依次给予生理盐水、pEGFP-N1载体和质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1分别复合脂质体转染。转染后48 h荧光活体成像及肝脏切片观察,定期测定血清胰岛素样生长因子1质量浓度。 结果与结论：转染后pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组大鼠均可见全身大部出现明显荧光表达,以肝脏及尾部为著,肝脏切片镜下观察可见明显荧光表达。去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度显著降低(P < 0.05);pEGFP-N1-IGF-1转染使去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度明显升高(P < 0.05),而后随时间延长而逐渐降低(P < 0.05)。结果证明质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1能够在骨质疏松大鼠体内成功转染并表达胰岛素样生长因子1蛋白,为应用胰岛素样生长因子1基因治疗骨质疏松症提供了理论基础。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景：在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。 目的：课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。 材料：人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。 方法：从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组：pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。 主要观察指标：使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。 结果：转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P < 0.05或0.01)。 结论：实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。     

Beclin 1 基因对恶性胶质瘤细胞 U87 自噬活性和增殖的影响简

目的研究BeclinJ基因对U87胶质瘤细胞自噬和增殖的影响。方法实验分5组：空白对照组．pSUPER—Bec组（表达BeclinsiRNA）与其阴性对照组（pSUPER—non组）,pcDNA3．1-Bec组（表达BeclinJ基因质粒）与其阴性对照组（pcDNA3．1-non组）。分别转染U87细胞,采用免疫印迹检测Beclin1、LC3和p62蛋白在各组的表达;用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）检测各组细胞增殖率。结果转染后48h,pSUPER—Bec组Beclin1、LC3B—11蛋白表达下降,p62蛋白表达升高。pcDNA3．1-Bec组Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达升高,p62蛋白表达下降。与空白对照组或pcDNA3．1-non组相比．pcDNA3．1-Bec组细胞增殖速度降低（P〈0．05）,其他各组细胞增殖速度无明显差异。结论恶性胶质瘤细胞中自噬相关基因Beclinj表达下降,过表达Beclinl蛋白能增强细胞的自噬活性,抑制细胞的增殖活性。     

血管内皮生长因子基因修饰诱导多能干细胞的生物学特性的研究

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因修饰诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的生物学特性。方法 将培养好的iPS细胞分为3组,即N0(纯iPS培养)组、N1(空腺病毒载体转染iPS)组、N2(转染VEGF基因的iPS)组; 3组细胞分别进行传代培养,并采用MTT方法检测转染VEGF基因对细胞增殖的影响; 采用酶联免疫(ELISA)方法检测细胞培养上清液中VEGF的表达水平。结果 转染VEGF基因对iPS细胞增殖没有明显影响; N2组iPS细胞分泌的VEGF蛋白表达水平较N1组显著增加(P<0.05)。结论 经VEGF基因转染的iPS可正常存活生长,并可稳定表达该基因。     

TrkA基因修饰、诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元

目的研究外源性TrkaA基因修饰C17．2神经干细胞，对神经干细胞定向分化的影响。方法采用脂质体法将携带有TrkA基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/TrkA转染C17．2神经干细胞，Western blot观察转染后基因表达情况；将正常生长的C17．2神经干细胞随机分成两组（A组和C组），将重组质粒转染阳性的C17．2神经干细胞随机分成两组（B组和D组），并用100ng／mg神经生长因子（NCF）分别作用于C组及D组，应用间接免疫荧光染色方法，观察各组细胞胆碱乙酰转移酶（CHAT）的表达。结果Western blot结果显示转染组TrkA蛋白表达明显高于非转染组，说明外源性TrkA基因导入靶细胞，并实现蛋白表达；间接免疫荧光染色显示，经NGF孵育的转染组细胞（D组）约有26％呈ChAT阳性，而非转染组（C组）约为9％，未经NGF孵育的A、B组未观察到CHAT阳性细胞。结论应用外源性TrkA基因修饰神经干细胞，造成TrkA基因过度表达，在NGF作用下，可以诱导更多的神经干细胞向胆碱能神经元分化。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H2O2)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。