老年痴呆噬菌体抗体库的构建及抗Aβ肽单链抗体的筛选

目的: 构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv).方法: 利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库.以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一个抗Aβ scFv-H1,并对其重链和轻链可变区基因进行测序分析.利用预吸附实验及竞争性ELISA测定该抗体对Aβ40的特异性及结合位点. 结果: 成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106.从库中筛选出1株抗Aβ40的单链噬菌体抗体-H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列.预吸附及竞争性ELISA证实该抗体对Aβ40的结合表位位于蛋白氨基端的1到16个氨基酸内. 结论: 利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性scFv,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径.     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

β-淀粉样蛋白特异性单链抗体的制备及鉴定

目的制备1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv),并进行性能鉴定。方法利用噬菌体展示技术,用20个AD病人的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ1-40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一株抗Aβ单链抗体H1,对其重链和轻链可变区基因进行测序分析。通过表达载体pET28a(+)对目的蛋白进行大量表达,并利用Western-blot对单链抗体H1的免疫活性进行鉴定。结果成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106。从库中筛选并表达出一株抗Aβ1-40的单链抗体H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列。Western-blot检测证实该抗体可特异性结合Aβ1-40。结论利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性单链抗体,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径。     

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的：构建人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa（GPIIb／IIIa）Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPIIb／IIIa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究。方法：取血小板膜糖蛋白抗体（抗GPIIb／IIIa）阳性的特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPIIb／IIIa Fab噬菌体抗体库,以表达GPIIb／IIIa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响。结果：筛选出2株能够与血小板膜GPIIb／IIIa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集。结论：成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体库筛选出特异性识别GPIIb／IIIa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体。     

噬菌体呈现技术在人抗体库中的研究策略

噬菌体呈现抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命 ,发展构建库容量大、特异性高和敏感强的人源性抗体库是噬菌体呈现技术的关键。本文就如何提高转化效益、实验策略及抗体应用的研究等方面作一综述。     

肝癌细胞特异性结合抗体的筛选及序列测定

目的通过噬菌体展示技术筛选与肝癌细胞特异性结合的抗体.方法用肝癌细胞系SMMC7721免疫小鼠,提取脾细胞总RNA,构建单链抗体库,从中筛选特异性结合的抗体.结果构建了一个库容量为2×105的单链抗体库,并筛选到1个与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体-单链抗体.此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低125倍以上.结论本研究成功构建了单链抗体库并筛选到与靶细胞特异性结合的噬菌体-单链抗体.     

噬菌体抗体库筛选技术研究进展

噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来, 组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体, 即为噬菌体抗体库 [1]。经特定抗原或细胞筛选后, 便可获得特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤 [2, 3]。1　噬菌体呈现人抗体库的基本原理噬菌体抗体在膜表面表达, 是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合, 又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性, 以靶抗原通过亲…     

人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选

目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础     

HAV噬菌体抗体特异性的鉴定

ＨＡＶ噬菌体抗体特异性的鉴定万泽生王海涛姜绍谆近年出现的噬菌体抗体库技术，使人们能够不经过细胞融合，采用基因工程的方法，从人外周血淋巴细胞ＩｇｍＲＮＡ直接制备抗体。我们利用这一技术，已成功地构建了噬菌体抗体库〔１〕。本文报道从库中筛选具有抗甲肝病毒（...     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

利用大型天然噬菌体抗体库筛选抗死亡受体5人源抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗人死亡受体5(DR5)单链抗体(sc Fv)并对其抗原结合活性进行鉴定。方法以前期真核表达纯化的DR5-Fc蛋白包被筛选管,从自主构建的大容量天然噬菌体抗体库中,通过4轮筛选过程获得噬菌体抗体,采用免疫细胞化学染色、ELISA鉴定其抗原结合活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。结果经过4轮筛选,获得26株与DR5特异性结合的阳性克隆,DNA指纹分析有4种不同的可变区片段;经过基因测序,分析可变区基因的亚群,并将其制备成可溶性的抗体,进一步用免疫细胞化学技术证实所获得的抗体可特异性结合SW480细胞的DR5蛋白。结论利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗DR5的人源性sc Fv。     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库, 从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv), 并对其特异性进行鉴定.方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库.对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选, 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序.结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库.对抗体库进行3轮正负淘选和富集后, 随机挑取2 798个克隆进行ELISA, 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应, 而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应.对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定, 结果与ELISA一致.免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义.结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库.通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆, 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.     

黑素瘤患者噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建噬菌体抗体库并筛选抗黑素瘤细胞的人抗体。方法 :从 1例长期存活的黑素瘤患者的外周血中分离单个核细胞 (PBMC) ,提取总RNA ,并逆转录为cDNA。用PCR扩增多样性κ链基因和重链Fd段基因 ,分别构建κ链库和重链库 ,组合为Fab段噬菌体抗体库 ,用两种黑素瘤细胞系对抗体库进行筛选和鉴定。结果 :所构建的噬菌体抗体库的库容量达 1.2× 10 8,用两种黑素瘤细胞系进行亲和吸附筛选 ,获得针对其中 1种黑素瘤细胞系的特异性抗体。结论 :采用噬菌体抗体库技术 ,成功地从 1例长期存活的黑素瘤患者体内克隆到特异性抗黑素瘤细胞的抗体 ,为进一步的研究和应用奠定了基础     

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的:构建人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPIⅡb/Ⅲa)Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPⅡb/Ⅲa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究.方法:取血小板膜糖蛋白抗体(抗GPⅡIb/Ⅲa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库,以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响.结果:筛选出2株能够与血小板膜GPⅡb/Ⅲa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集.结论:成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体库筛选出特异性识别GPⅡb/Ⅲa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体.     

抗淋巴细胞激活基因3(LAG-3)全人源抗体的制备

目的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)是一个极具潜力的肿瘤治疗靶点。本研究旨在从大容量全人源噬菌体抗体库中筛选抗LAG-3的单链抗体(scFv),将其转化为完整的全人源抗体。方法从全人源噬菌体抗体库,筛选抗LAG-3全人源噬菌体scFv,ELISA鉴定噬菌体scFv的特异性,采用表面等离子共振技术(SPR)测定其亲和力,再通过真核表达系统获得抗LAG-3全人源完整抗体。结果通过3轮筛选富集,获得了4个具有特异结合活性的scFv。亲和力测定最高的达到3.48×10~(-10)。再通过构建完整的抗LAG-3全人源抗体表达载体,经真核细胞表达、纯化后,获得了3株特异性抗LAG-3全人源抗体。结论利用大容量全人源噬菌体抗体库,成功筛选并表达出3种高亲和力和特异性的抗LAG-3全人源抗体。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库。方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coliTG1,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率。使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库。以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体。结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。