大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架体内构建牙体组织-骨复合体样结构的研究

目的: 探讨不同组合生长因子诱导的大鼠牙源性上皮细胞(rDECs)、间充质细胞(rDMCs)复合nHAC/PLA支架体内形成牙体组织-骨复合体样结构的能力。方法: 应用酶消化法和差速消化法分离培养rDECs和rDMCs,免疫荧光染色鉴定其来源。将各组细胞-支架复合物移植裸鼠皮下3月、5月后分别取材,检测移植物形成牙体组织-骨复合体样结构能力。结果: 成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和间充质细胞。细胞-支架复合物移植后3月,组①、②、③在细胞-支架接触部位均发现类骨质、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的阳性表达。组②促成骨作用最强。对照组④没有新生骨形成,仅有少量胶原纤维和血管。移植后5月,组①、③均形成没有髓腔的牙根样结构,部分区域有DSPP、DMP1、CAP表达。组②形成周边有新生骨、中央有单根牙体样组织,中心为含有牙髓样组织和血管的髓腔样结构,并有DSPP、DMP1、OPN、OCN在髓腔内壁牙本质基质、部分牙髓样组织和血管内的阳性表达,ameloblastin、CAP分别在釉质样、牙骨质样组织中表达阳性。对照组④形成新生骨,OCN强阳性表达,未形成牙体样结构。结论: 经TGF-β1+BMP4诱导的rDECs + rDMCs-nHAC/PLA体内移植物促成骨和成牙作用最强,移植后5月形成牙体组织-骨复合体样结构。     

不同因子对大鼠牙源性间充质细胞成牙本质分化的影响

目的： 探讨bFGF、IGF1、BMP4、TGF-β1联合应用对大鼠牙源性间充质细胞（rat dental mesenchymal cells, rDMCs）成牙本质分化的影响。方法：应用酶消化法和差速消化法分离、培养大鼠牙源性上皮细胞（rDECs）和rDMCs,经cytokeratin、vimentin免疫荧光染色鉴定其来源。应用茜素红染色、Gomori钙-钴法检测矿化液诱导下rDMCs的矿化能力。应用免疫组织化学染色、图像分析、实时荧光定量PCR和Western 印迹法检测在bFGF+IGF1（组1）、TGF-β1+BMP4（组2）、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4（组3）分别诱导下 rDMCs中DSPP、CAP、OPN、OCN的表达差异。采用SPSS14.0软件包对数据进行统计学分析。结果：成功分离培养、鉴定rDECs和rDMCs,经矿化液诱导后的rDMCs钙结节和ALP染色阳性。组1、2中,DSPP、CAP、OPN、OCN mRNA和蛋白的表达水平均显著高于空白对照组4,差异显著（P<0.01）,其中组1 CAP、OCN和组2 DSPP、OPN的表达水平最高。结论：rDMCs经矿化诱导后具有成骨特性。bFGF+IGF1显著促进CAP、OCN的表达,加速rDMCs向成牙骨质细胞、成骨细胞分化与牙骨质基质、骨基质的矿化;TGF-β1+BMP4显著促进DSPP、OPN的表达,加速rDMCs向成牙本质细胞、成骨细胞分化与牙本质基质、骨基质的矿化,显示其成骨趋向。4种因子联合应用,并不具备显著的协同作用。     

用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程化牙齿样结构的实验研究

目的：以人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞在裸鼠体内构建牙齿样结构。方法：将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的陶瓷化骨或Collagraft三维支架上，将形成的细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的体内立体培养模型。14～18周后取材，采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物中的组织新生情况。结果：细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。新生的釉质样组织表达人成釉蛋白，其周围残留的牙源性上皮细胞表达人釉原蛋白mRNA。同时，人DSP蛋白在牙本质样组织中呈阳性表达。所有对照组标本中均未观察到该现象。结论：以优选出并经塑形的三维支架为载体，在裸鼠体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，成功构建出组织工程化牙齿样结构。     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞，用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量成纤维细胞混杂，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后，细胞逐渐变为长梭形，失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性，有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。     

ADAM28基因在牙源性细胞中的表达分布

目的：探讨ADAM28在牙源性上皮和间充质细胞中的表达差异,明确其亚细胞定位情况.方法：采用免疫细胞化学、免疫荧光和RT-PCR技术,从蛋白和基因水平检测ADAM28在人牙乳头细胞（HDPC）、牙囊细胞（HDFC）、牙髓干细胞（HDPSC）、牙周膜细胞（HPDLC）和颈环上皮细胞（HDCLEC）的表达分布.结果：ADAM28在上述五种细胞的胞浆和胞膜上均有强弱不等的阳性表达.结论：ADAM28可能作为一种胞浆蛋白调控着牙源性细胞的增殖与分化,在牙胚发育中起重要作用.     

人牙源性间充质细胞构建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的以复合生长因子的陶瓷化骨和Collagraft为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建牙本质-牙髓复合体样结构。方法将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子的陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞-支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和人牙本质涎蛋白（DSP）的免疫组化染色。结果10周的实验组标本中，植入细胞在复合生长因子支架上形成了较典型的牙本质-牙髓复合体样结构，人DSP在新生牙本质样组织中呈阳性表达。对照组及4周标本中未观察到此现象。结论用人牙源性间充质细胞和复合生长因子的陶瓷化骨或Collagraft支架材料在裸鼠体内可成功构建出牙本质-牙髓复合体样结构。     

人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立--构建组织工程化牙本质和牙髓组织

目的：以陶瓷化骨和Collagraft复合材料为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建组织工程化牙本质和牙髓组织。方法：将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞/支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和DSP的免疫组化染色。结果：10周的实验组标本中，植入的细胞在支架上形成了不太典型的牙本质和牙髓样组织，新生的牙本质样组织和其内侧出现极化的细胞均表达人DSP。对照组和4周标本中未观察到此现象。结论：用人牙源性间充质细胞和Collagraft或CBB载体在裸鼠体内可成功构建出组织工程化牙本质和牙髓样组织。     

纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料与骨髓基质细胞体外复合的实验研究

目的了解兔BMSCs与nHAC/PLA材料在体外共培养时细胞与材料复合的情况,进一步验证nHAC/PLA材料作为骨组织工程支架材料的可行性。方法将兔BMSCs与nHAC/PLA材料在体外复合共培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法及碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖、分化的影响。结果BMSCs可以在nHAC/PLA材料表面及孔洞中良好地粘附、迁移、增殖和分化,复合培养5天后nHAC/PLA材料对BMSCs的增殖及分化表现出一定的促进作用。结论nHAC/PLA材料可以作为BMSCs良好的载体。     

三维石墨烯及其衍生物在牙源性干细胞成骨中的研究进展

石墨烯是作为一种新兴材料,在生物医学领域的研究近年来逐渐增多.三维石墨烯是指具有三维结构的二维石墨烯组装体,三维结构提升了石墨烯的多孔性、比表面积等,更适于细胞粘附、生长,使其具有诱导间充质干细胞成骨的能力.本文以三维石墨烯及其衍生物的理化性质和生物相容性为基础,对三维石墨烯及其衍生物诱导牙源性干细胞成骨作用的研究进展...     

BMP-9/EPO双基因共转染ADSCs复合nHAC/PLA支架修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的：探讨腺病毒介导BMP-9/EPO双基因共转染脂肪干细胞（ADSCs）复合nHAC/PLA支架材料促进体内成骨的可行性。方法：分离培养兔ADSCs,利用重组腺病毒构建携带BMP-9、EPO、BMP-9/EPO基因的表达载体,并转染至兔ADSCs。14 d后,在荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况,计算病毒转染效率,采用Western免疫印迹检测各组细胞 BMP-9及EPO蛋白的表达。50只大白兔随机分为5组,A组为空白组,B组为单纯材料组,C组为BMP-9/nHAC/PLA组,D组为EPO/nHAC/PLA组,E组为BMP-9/EPO/nHAC/PLA组。制备兔双侧下颌骨缺损模型,按照实验分组,将转染组细胞分别与nHAC/PLA支架复合培养后植入兔下颌骨缺损处,于4、8、12周在缺损处取材进行影像学、组织学检测及扫描电镜观察,比较各组动物下颌骨缺损修复情况。采用 SPSS17.0软件包对结果进行统计学分析。结果：荧光显微镜下观察,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染 ADSCs,转染效率为 80%～93%。转染后,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO基因和蛋白均能稳定表达。转染后的ADSCs与nHAC/PLA支架复合,其骨缺损区修复情况优于对照组,且BMP-9/EPO/nHAC/PLA组成骨情况优于其他各组。扫描电镜下见转染组骨缺损与材料结合修复情况优于对照组,BMP-9/EPO/nHAC/PLA组修复最明显。结论：BMP-9、EPO均可转染ADSCs并稳定表达。与nHAC/PLA支架材料复合后,可显著促进下颌骨缺损的修复,为骨组织修复工程提供了新的选择。     

活性纳米羟基磷灰石复合胶原聚乳酸材料异位成骨性能研究

目的：探讨既具有骨引导性又具有骨诱导性的活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸（AnHAC/PLA）材料的异位成骨能力,为该材料作为植骨材料应用于临床打下实验基础。方法：通过扫描电镜观察rhBMP-2与nHAC/PLA材料的复合情况,并将nHAC/PLA、rhBMP-2、AnHAC/PLA材料分别植入小鼠股后肌袋内,术后2周、6周通过X线片、组织学观察、成骨量测定来研究AnHAC/PLA的异位成骨能力。结果：rhBMP-2在nHAC/PLA孔隙中均匀分布,6周时AnHAC/PLA组诱导形成的骨量是rhBMP-2组的10.5倍。结论：AnHAC/PLA材料具有良好成骨能力,nHAC/PLA是rhBMP-2理想的缓释载体。     

人牙龈成纤维细胞诱导分化为骨骼肌细胞的探讨

目的探讨人牙龈成纤维细胞向骨骼肌细胞分化的潜能和可能性。方法①收集河北医科大学口腔医院口腔颌面外科下颌阻生齿拔出后切除的牙龈组织。采用组织块培养法,培养液选用含20％胎牛血清的低糖DMEM培养传代。采用波形蛋白（vimentin）和骨骼肌肌动蛋白（α-sarcometric actin）＆肌球蛋白（myosin）的免疫细胞化学、Masson特殊染色进行鉴定。②采用含10％胎牛血清DMEM／F12混合培养液,应用5-氮杂胞苷（azacytidine,5-aza）、成肌分化因子（myogenic differentiation factor,Myod）、胰岛素样生长因子-1（insulin—like growth factors-1,IGF-1）对人牙龈成纤维细胞诱导培养38天,采用vimentin和α-sarcometricacfin＆myosin的免疫细胞化学、Masson特殊染色进行鉴定。扫描电镜观察细胞形态学特征。结果①牙龈组织原代培养7-10天,细胞爬出,成纤维细胞呈梭形、胞体大,核大圆形。对波形蛋白（vimentin）呈阳性反应。②人牙龈成纤维细胞经诱导培养38天细胞后,形态变为长圆柱状或棒状,胞浆两端突起消失。对α-sarcometricactin＆myosin呈阳性表达,Masson染色胞浆着红色。呈现骨骼肌细胞的形态特征。结论人牙龈成纤维细胞能够诱导分化为骨骼肌细胞。     

大鼠唾液腺细胞体外原代培养的一种新方法

目的 建立大鼠唾液腺上皮细胞体外原代培养模型,为体外研究唾液腺疾病提供种子细胞。方法 在无菌条件下取出生1~2 d的Wistar大鼠腮腺组织,手术显微镜下去除腺体包膜,以无血清培养基( kerotinocyte-SFM )为培养液,并添加表皮生长因子( rat epidermal growth factor, rEGF )、牛垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE)、氢化可的松(hydrocortisone,HC)、转铁蛋白(transferrin,Tf)、胰岛素(insulin,INS)等因子,应用组织块培养法进行培养。用倒置相差显微镜观察培养细胞体外生长的形态特征。用H-E染色及细胞角蛋白、波形蛋白免疫组织化学染色对培养的细胞进行形态学检查和鉴定。结果 培养的腮腺上皮细胞为三角形、多边形、圆形、短梭形,细胞单层生长,连接疏松。H-E染色可见细胞多为圆形,核蓝染,细胞有突起、细胞间桥。细胞角蛋白染色阳性,证实所培养细胞为上皮来源;Vimentin、actin和calponin染色细胞大部分呈阳性,进一步确定细胞主要为肌上皮细胞。原代细胞在3~5 d内保持良好的生长状态,并存活1周左右。结论 组织块培养法可以简捷、快速地获得大鼠腮腺上皮细胞,成功建立Wistar大鼠腮腺上皮细胞的体外模型。     

矿化液促进犬牙周膜细胞异位成骨实验

目的：探讨矿化液对犬牙周膜细胞（PDLCs）体外诱导分化、体内成骨作用的影响。方法：酶消化法原代培养成年犬前磨牙PDLCs并鉴定。再以含地塞米松、β甘油磷酸钠和抗坏血酸的矿化液连续诱导PDLCs，观察细胞形态变化，检测骨涎蛋白（BSP）表达碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导14d的细胞接种于钠米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸复合支架（nHAC／PLA）上，体外培养5d后植入犬自体皮下，8W取材HE、三色法染色评价骨形成情况。以未诱导细胞为对照。结果：PDLCs波形丝蛋白（VIM）表达阳性，角蛋白（CK）阴性。矿化诱导后强阳性表达BSP，ALP活性也显著升高，提示细胞向成骨样细胞分化。体内移植8W，组织学见对照组主要形成纤维样组织而诱导组形成大量骨样组织。结论：矿化液具有促进PDLCs体外向成骨细胞分化和体内成骨作用。     

口腔鳞癌癌细胞和癌相关成纤维细胞的原代培养、鉴定及其生物学特性研究

目的：对口腔鳞状细胞癌细胞（OSCCs）及癌相关成纤维细胞（CAFs）进行培养、纯化和鉴定,初步探讨其生物学特性。方法：取自临床手术的新鲜标本,通过抗污染处理,应用机械分离法和胶原酶Ⅳ消化法获得OSCC及CAFs,0.25%胰蛋白酶消化反复贴壁差数培养法分离、纯化细胞,正常口腔成纤维细胞（NFs）和舌鳞癌细胞系Tca8113作为对照组。通过形态学观察、波形蛋白和角蛋白免疫组化染色对纯化的细胞进行鉴定。应用MTT法绘出OSCCs、CAFs、NFs和Tca8113细胞的生长曲线。结果：获得纯化的OSCCs和CAFs,通过对比研究阐明OS-CC和CAFs的生物学特点;OSCCs中免疫组化染色角蛋白呈阳性、波形蛋白呈阴性,CAFs中角蛋白呈阴性、波形蛋白呈阳性。结论：通过本实验研究成功获得纯化的OSCCs和CAFs,对比研究发现CAFs和NFs在形态结构、生长特点等方面不同。     

EMPs对人牙髓干细胞增殖分化影响的实验研究

目的：将人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）与釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）按一定浓度结合,测定牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、波形蛋白（vimentin）、碱性磷酸酶（alkaline phophatase,ALP）的表达,阐述EMPs对人牙髓干细胞增殖分化的影响.方法：分别将浓度为100 μg/mL、200μg/mL的EMPs加入培养中的人牙髓干细胞中,分别于3d、5d、7d、9d、11d对细胞进行免疫组化染色,检测细胞爬片DSPP、vimentin、ALP的表达.结果：未经EMPs诱导的人牙髓干细胞DSPP少量细胞阳性表达,vimentin表达阴性,ALP表现低活性.经200 μg/mL的EMPs诱导5d后,人牙髓干细胞DSPP、vimentin染色呈阳性表达,ALP活性明显增加.结论：EMPs对人牙髓干细胞增殖及分化具有促进作用,200 μg/mL的浓度效果最为显著.     

人腮腺多形性腺瘤细胞的体外培养

目的:建立人腮腺多形性腺瘤有限细胞系.方法:取腮腺多形性腺瘤患者原发肿瘤进行原代培养.观察细胞的形态特征,绘制细胞生长曲线,采用免疫细胞化学检测细胞内特异性抗原标志物,对细胞进行鉴定.结果:多形性腺瘤细胞体外培养时间约为80d,传代至16代,细胞呈短梭形、多边形,肿瘤性腺上皮细胞角蛋白弱阳性,肿瘤性肌上皮细胞肌动蛋白阳性、波形蛋白阳性.结论:多形性腺瘤细胞在体外培养连续传代,为永生化腮腺多形性腺瘤细胞系的建立奠定了基础.     

快速成型技术构建聚己内酯支架作为骨支架材料的研究

目的：运用快速成型技术（RP）构建聚己内酯（PCL）支架,检测其生物相容性,探讨成为组织工程骨支架的潜力。方法：以聚己内酯为原料利用熔融沉积成型法（FDM）制备无孔隙及孔径300μm、500μm 3种PCL支架,比重瓶法测孔隙率。利用MTT法检测支架材料对细胞增殖的影响。倒置荧光显微镜、扫描电子显微镜观察聚己内酯支架上的细胞粘附情况及细胞形态。结果：肉眼观察可见300μm及500μm孔径支架材料孔隙大小均匀,排列规整,层次分明,两种孔径支架都具有良好的孔隙连通率。MTT检测结果显示1d、2d、3d各时间点均无明显细胞毒性,细胞毒性为1级。荧光倒置显微镜下观察发现细胞粘附数量由无孔隙组、500μm孔径组、300μm孔径组依次增加。扫描电子显微镜下观察细胞紧密粘附于支架。结论：用快速成型技术制备的聚己内酯支架具有较高的孔隙率,孔隙之间连通率良好,生物相容性良好,细胞粘附良好,有望成为骨组织工程支架。