胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙周膜细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14 d后,免疫细胞化学检测骨涎蛋白的表达;von Kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白-1、碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14 d,实验组骨涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von Kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组骨涎蛋白表达阴性,von Kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶、LIM矿化蛋白-1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白-1的表达显著高于对照组,其中培养第3 d、14 d时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.4倍、1.5倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著增高,其中培养14 d时约为对照组的1.5倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白-1与人牙周膜细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白-1可能在牙周膜细胞的分化、矿化中发挥一定作用。     

胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14d时约为对照组的2.0倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用。     

研究两种干细胞体外矿化过程中LIM矿化蛋白1的表达

目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种胞内非分泌型蛋白,广泛存在于各种组织中,它不仅影响骨基质的矿化而且还是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调节因子。本实验通过检测LMP-1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程中的表达情况,来研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1对牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化的作用,为LMP-1作为成骨调节因子,影响骨基质矿化方面的研究提供参考。方法酶消化法体外培养牙髓干细胞,用挑克隆细胞团的方法对牙髓干细胞进行纯化传代培养。密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞。两种细胞分别设置实验组和对照组。实验组培养液中加入矿化诱导液,对照组不加矿化诱导液。分别于培养3、5、7、14天检测碱性磷酸酶的活性。培养21天茜素红染色检测矿化结节形成。培养期间,采用荧光定量PCR方法检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白BMP-2、牙本质涎磷蛋白DSPP和Ⅰ型胶原蛋白COL-1、核心结合因子RUNX-2等成骨标志基因的表达,用SPSS 17.0对结果进行统计学分析。结果培养3、5、7、14天碱性磷酸酶的活性逐渐提高,且实验组碱性磷酸酶的活性显著高于对照组。培养21天实验组可见矿化结节形成。荧光定量PCR检测到实验组及对照组各个基因均表达,且实验组表达显著高于对照组。结论发现LIM矿化蛋白1与牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程相关,推测LIM矿化蛋白1可能作为检测牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化的一个指标。     

FHL2蛋白在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达

体外培养hPDLCs,实验组用矿化诱导液培养,对照组不加诱导液。培养0、14、28d后,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫细胞化学法检测hPDLCs矿化诱导0、14d时FHL2蛋白的表达;同时采用半定量RT-PCR方法检测hP-DLCs矿化诱导0、14、28d时FHL2 mRNA的表达。结果:诱导培养14、28d后,实验组茜素红染色阳性,矿化结节形成;对照组茜素红染色显示:无明显矿化结节形成。免疫细胞化学结果显示:实验组FHL2蛋白阳性表达     

成骨生长肽对体外人牙髓细胞增殖和矿化作用的影响

目的 观察成骨生长肽(OGP)对体外人牙髓细胞增殖和矿化作用的影响.方法 酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞(hDPCs),倒置相差显微镜观察hDPCs的形态.CCK-8、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测筛选最佳浓度OGP;最佳浓度组、对照组、单纯矿化液组和含最佳浓度的矿化液组做茜素红、Von Kossa染色和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测.结果 酶消化组织块法可以良好的体外培养hDPCs;OGP浓度在10-7 ～ 10-11 mol/L均能促进hDPCs增殖和ALP活性:促增殖最佳浓度为10-10 mol/L,随时间延长,与10-9 mol/L浓度组间差异无统计学意义;OGP浓度为10-9 mol/L时能显著增强ALP活性.茜素红和Von Kossa染色观察第14、21天,四组均有钙化结节形成,联合组结节最大,数量最多;RT-PCR结果显示第7、14、21天,联合组的Ⅰ型胶原、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OCN)的mRNA表达量均高于其他各组(P ＜ 0.01).结论 OGP能促进体外hDPCs的增殖和分化,结合两者最优浓度为10-9 mol/L;茜素红和Von Kossa染色可以观察钙化结节形成过程;OGP联合矿化诱导液可以显著提高体外hDPCs的矿化.     

矿化液对体外培养的人牙囊细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的：探讨矿化液对体外培养的人牙囊细胞中碱性磷酸酶表达的影响。方法：取12～13岁患者因正畸原因拔除的下颌第三磨牙牙囊，原代培养人牙囊细胞，将第5代细胞加入矿化液培养，应用碱性磷酸酶组织化学方法染色、碱性磷酸酶试剂盒检测人牙囊细胞中碱性磷酸酶的活性。结果：培养的牙囊细胞呈长梭形、不规则多角形。免疫细胞化学染色显示抗波形丝蛋白染色阳性。矿化液诱导7d，碱性磷酸酶染色呈阳性，碱性磷酸酶活性检测第3、5、7d明显升高，与对照组均有显著性差异。结论：矿化液能增强体外培养的人牙囊细胞中碱性磷酸酶的表达。     

FHL2蛋白在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达

目的 探讨胞内信号转导分子FHL2蛋白在人牙周膜细胞(hPDLCs)体外矿化过程中的表达.方法 体外培养hPDLCs,实验组用矿化诱导液培养,对照组不加诱导液.培养0、14、28 d后,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫细胞化学法检测hPDLcs矿化诱导0、14d时FHL2蛋白的表达;同时采用半定量RT-PCR方法检测...     

陶瓷化骨对人牙囊细胞分化的影响

目的:培养人牙囊细胞(DFCs),观察陶瓷化骨(CBB)对人牙囊细胞生长和分化的影响.方法:体外分离胚胎期人DFCs,将第三代细胞以CBB为载体立体培养,以平面接种为对照组,用矿化液持续诱导,利用光镜观察细胞生长状态、免疫组织化学观察细胞矿化基质牙骨质附着蛋白(CAP,)及骨涎蛋白抗体(BSP)分泌、Vokassa染色观察矿化情况,了解CBB对DFCs生物学行为的影响.结果:体外连续诱导28 d,实验组光镜下可见DFCs与CBB相容性好,材料周边细胞生长密集,并有向BBC趋化迁移现象,附近细胞聚集,形成Vokassa染色阳性的矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阳性着色,部分细胞强阳性着色.对照组细胞复层生长,未形成矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阴性着色.结论:体外培养条件下,CBB可诱导人DFCs向成骨和成牙骨质细胞分化.     

永生化人成牙本质细胞样细胞系体外矿化的初步观察

目的:探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-1的体外矿化特征。方法：在矿化液连续培养细胞5周，采用倒置显微镜、透射电镜进行组织学观察以及Von Kossa染色。结果：细胞在矿化液中生长良好，形成细胞结节，分泌细胞外基质，其中有平行排列的胶原纤维和针状晶体沉积。Von Kossa染色显示细胞结节已发生矿化。结论:hTERT-hOd-1细胞在体外培养条件下具有矿化能力。     

牙周韧带细胞体外矿化的研究——骨唾蛋白与骨桥素在矿化过程中的表达

目的：研究骨唾蛋白与骨桥素在体外培养的人牙周韧带细胞矿化过程中的表达。方法：体外培养的人牙周韧带细胞，经地塞米松矿化液诱导，分别于不同时间在相差显微镜下观察其矿化结节的形成，采用免疫细胞化学的方法观察骨唾蛋白与骨桥素的表达情况。结果：矿化培养1周细胞呈复层生长，骨桥素呈阳性染色；两周细胞密集呈结节状，骨唾蛋白与骨桥素均为阳性，胞浆染成黄褐色；3周出现矿化结节，矿化以后骨唾蛋白与骨桥素保持稳定表达。结论：牙周韧带细胞在适当的条件下可以向成骨细胞表型分化，表达矿化相关蛋白，形成矿化结节。     

LIM矿化蛋白1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中的研究进展

LIM矿化蛋白1(LMP-1)是一种胞内信号转导分子,体内外研究表明它在成骨细胞分化过程中起到促进骨形成的重要作用。目前认为LMP-1是通过刺激某些诱导骨形成的因子如骨形态发生蛋白(BMP)的合成及分泌发挥作用,从而提高骨形态发生蛋白及其他成骨因子的成骨活性。该文围绕LMP-1的作用及在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化方面的研究现状作一综述。     

携带RUNX2基因突变的人牙囊细胞的分离培养及鉴定

目的：研究携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞的分离、鉴定及意义。方法：收集颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）患者,鉴定其致病基因RUNX2的突变位点,通过离体培养CCD患者的未萌牙牙囊细胞,检测其携带的基因突变位点,鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞。结果：全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,该突变型为c.309_310insTG,成功分离培养及鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞,并发现RUNX2基因突变减少了牙囊细胞中此蛋白的表达水平。结论：成功分离培养携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞,为进一步研究RUNX2基因在牙囊及牙齿萌出中的作用提供实验模型。     

巨噬细胞集落刺激因子对体外培养人牙囊细胞破骨细胞分化因子表达的影响

目的：研究巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞破骨细胞分化因子（RANKL）mRNA表达的影响。方法：原代培养人牙囊细胞，传至第3代，制备细胞爬片，进行RANKL免疫组化染色；选取生长状态良好的第3-6代人牙囊细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，培养基中分别加入25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子，共同孵育0．5、1、3、6、12h，提取总RNA进行RT-PCR，灰度值半定量分析RANKL mRNA的变化。结果：正常人牙囊细胞RANKL蛋白表达阳性；25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子可升高人牙囊细胞RANKL的表达；共同孵育3h，RANKL表达最高。结论：巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞表达RANKL，具有正向调节作用。     

CSF-1和PTHrP对人牙囊细胞OPG表达的影响

目的:研究集落刺激因子(colony-stimulating factor-1,CSF-1)和甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hor-mone-related protein,PTHrP)对体外培养的人牙囊细胞(dental follicle cells,DFC)表达骨保护素(osteo prote gerin,OPG)的影响。方法:原代培养人牙囊细胞,选第3~6代细胞,培养基中分别加入不同浓度的CSF-1和PTHrP与牙囊细胞共同孵育,MTT法检测人牙囊细胞的增殖活性;Sandwich ELISA测定培养上清液中OPG的含量。结果:25ng/ml的CSF-1和10ng/ml的PTHrP可以促进DFC增殖,并且此浓度两种因子分别与DFC共培养OPG表达均降低(P<0.05)。结论:在牙齿萌出的某时期牙囊自分泌和旁分泌的CSF-1和PTHrP有降低人牙囊细胞OPG表达的作用。     

CSF-1对体外培养人牙囊细胞OPG表达的影响

目的研究集落刺激因子(CSF-1)对体外培养的人牙囊细胞骨保护素(OPG)表达的影响。方法原代培养人牙囊细胞,传代至第3代,制备细胞爬片,进行OPG免疫组化染色;3~6代人牙囊细胞长至80%时,用胰酶消化,离心,重悬,制成单细胞悬液,接种到细胞培养皿,细胞长满至80%时,培养基中加入25ng/ml的CSF-1,孵育0.5、1、3、6h,分别收集上清液,ELISA法检测OPG蛋白分泌量的变化,提取总RNA进行RT-PCR,检测OPG mRNA的表达变化。结果正常人牙囊细胞OPG蛋白表达阳性;25ng/ml的CSF-1可降低人牙囊细胞OPG的表达,共同孵育1h,OPG表达降至最低(P<0.05)。结论牙囊细胞表达OPG,同时在牙齿萌出的特定时期,CSF-1通过下调人牙囊细胞OPG,减弱对破骨细胞形成的抑制作用,促进破骨细胞分化成熟,调节牙齿萌出。     

Regulation of secretion of osteoprotegerin in rat dental follicle cells

Tooth eruption requires alveolar bone resorption and formation, both of which appear to be regulated by the dental follicle. Osteoclastogenesis needed for this bone resorption appears to occur as a result of a reduction in the expression of the osteoprotegerin (OPG) gene in the dental follicle at a specific time. This reduction in expression is mediated in vitro in the follicle cells by colony-stimulating factor-1 (CSF-1) and parathyroid hormone-related protein (PTHrP). Using enzyme-linked immunosorbent assays and immunoblotting, this study shows that the reduction in expression of OPG after incubation of the dental follicle cells in either CSF-1 or PTHrP also results in a reduction in its secretion. We also show, by laser capture microdissection, that PTHrP is expressed in vivo in the stellate reticulum such that it could inhibit OPG expression via a paracrine effect on the follicle. Bone formation is enhanced by OPG secretion, and incubation of the follicle cells with bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) enhances OPG secretion. Thus, a reduction in secretion of the OPG protein at defined times may promote the osteoclastogenesis and alveolar bone resorption needed for eruption, and enhancement of OPG secretion at other times may promote alveolar bone formation.     

IGF-1对小鼠牙囊细胞生物学特性的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对小鼠牙囊细胞增殖、蛋白含量及分化能力影响。方法:将第3代小鼠牙囊细胞与不同浓度IGF-1(0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L)共孵育后,测定IGF-1对细胞增殖、碱性磷酸酶活性、总蛋白含量的影响;并用Von Kossa法检测0.05和0.1 mg/L的IGF-1对牙囊细胞矿化结节形成能力的影响。结果:在0.05~0.1 mg/L的浓度范围内,IGF-1能显著促进牙囊细胞的增殖,使ALP活性及总蛋白含量增加(P<0.01),但三者的最佳效应浓度有所差异,当浓度升高至0.5 mg/L时,促进效应下降,与对照组无显著性差异(P>0.05);0.05和0.1 mg/L的IGF-1均能显著促进牙囊细胞矿化结节的形成(P<0.05,与对照组相比)。结论:合适浓度的IGF-1能促进牙囊细胞的增殖,增加蛋白含量及向成骨细胞(成牙骨质细胞)方向分化的能力。