广西146例华支睾吸虫疑似感染者粪样虫卵和血清IgG抗体的检测分析

检测广西华支睾吸虫疑似感染者粪样华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵和血清华支睾吸虫IgG抗体,分析二者的相关性,为华支睾吸虫感染的监测和诊断提供参考。收集2017年3-9月于广西疾病预防控制中心预防性健康体检科就诊的疑似华支睾吸虫感染者粪样,采用改良加藤厚涂片法(一粪三检)检查华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵并计算每克粪样虫卵数(EPG)。同步收集粪检阳性患者的血液标本,采用间接ELISA法检测血清华支睾吸虫IgG抗体。分析EPG值与IgG抗体A_(450)值的相关性,并根据华支睾吸虫感染度分类标准,分析轻度、中度和重度感染者EPG值与血清IgG抗体阳性率以及IgG抗体定性结果与EPG值的关系。在146份华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵阳性粪样中,EPG最大值为21 502,最小值为8。血清华支睾吸虫IgG抗体阳性率为84.9%(124/146),男、女性IgG抗体阳性率分别为86.0%(111/129)和13/17,差异无统计学意义(P 0.05)。感染者EPG值和IgG抗体A_(450)值呈正相关性(r_s=0.436, P 0.01)。轻度、中度和重度感染者IgG抗体阳性率分别为78.4%(69/88)、 96.0%(48/50)和7/8,差异有统计学意义(P 0.05)。华支睾吸虫血清IgG抗体阳性组和阴性组粪样几何均数(GM EPG)值分别为736和204,差异有统计学意义(P 0.01)。提示在华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫共感染的广西,粪样虫卵镜检和血清华支睾吸虫IgG抗体检测结果呈正相关;但单独粪便虫卵检查用于华支睾吸虫监测和诊断会存在误判,应辅助IgG抗体等血清学检测。     

华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子的分子生物学及免疫学定位研究

目的由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究。方法生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法。结果由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了csRPEF（RNA聚合酶Ⅱ延长因子）基因。通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82％。成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白。凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85％和（0．73±0．02）mg／ml。将CsRPEF重组蛋白接种至BALB／c小鼠进行免疫实验。间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1：150。免疫识别结果显示此抗体可识别20ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20ku虫源性蛋白。S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位。CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119。结论CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析

目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。     

肝胆B超病理改变与华支睾吸虫感染感染的相关性探讨

目的探讨肝胆B超病理改变与华支睾吸虫感染的关系,为华支睾吸虫病诊断和治疗提供参考依据。方法对2010年1月至2013年12月,在武宣县人民医院行腹部B超检查发现的疑似华支睾吸虫感染者,采用粪检和酶联免疫法(ELISA)进行华支睾吸虫病原学和血清学检测。结果共检测疑似华支睾吸虫感染者113例,虫卵阳性率为64.60%(73例),血清抗体阳性率为66.37%(75例)。男性虫卵阳性率高于女性,50岁以上年龄组虫卵阳性率高于50岁以下组,差异均有统计学意义(χ2=3.554、6.267,P均0.05)。感染者的肝胆B超病理改变程度与华支睾吸虫感染度呈正相关(χ2=64.952,P0.01)。结论肝胆B超病理改变可能由华支睾吸虫感染引起,B超检查发现肝胆有病理改变者,应进一步进行华支睾吸虫病原学和血清学检测。     

华支睾吸虫PPMP型抗原基因的克隆、表达与免疫原性鉴定

目的筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找和鉴别新颖的抗原基因,并分析其重组蛋白的免疫原性方法以华支睾吸虫病患者混合血清免疫筛选华支睾吸虫成虫λZAP cDNA表达文库,将阳性噬菌体克隆、测序,对获得的核苷酸序列进行生物信息学分析。将目的基因成熟肽的编码区克隆至原核表达质粒pET28b(+),转化至大肠埃希菌BLR(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。以纯化的重组蛋白pET28b-Cs2免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,ELISA检测抗体水平。结果共获得44个阳性克隆,其中3个克隆的氨基酸序列中均含有PPMP重复序列,将其命名为华支睾吸虫PPMP型抗原,将其中含有KPPMPGDRDA、QPPMPGGRDA串联重复多肽序列的抗原分别称为PPMPⅠ型和PPMPⅡ型抗原。经核苷酸序列同源性比较,PPMP型抗原是一个新的华支睾吸虫特异性抗原家族。PPMPⅠ型的Cs2基因和PPMPⅡ型的Cs3基因的成熟肽编码区在大肠埃希菌BLR(DE3)或BLR(DE3)pLysS中表达,并获得可溶性重组蛋白,2个重组蛋白的相对分子质量分别为M_r 22 000和M_r 39 000。重组蛋白可被华支睾吸虫病患者血清所识别。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度(1:64000)特异性IgG抗体。结论发现华支睾吸虫PPMP型抗原基因家族,其重组蛋白具有较强的免疫原性。     

免疫金电转移印斑技术检测华支睾吸虫病人血清抗体

我们应用电转移印斑结合免疫金技术,进行了华支睾吸虫病人血清中抗体的研究,以寻找一个敏感、特异的华支睾吸虫病免疫诊断方法。一、材料和方法 (一)抗原的制备自人工感染华支睾吸虫囊蚴的猫肝中取华支睾吸虫成虫100条,以生理盐水洗涤数次.超声粉碎100w,10min,4℃冰箱冷浸72h,5000r/min离心15min,取上清液。 (二)实验血清1.华支睾吸虫病人血清:采自山东金乡县及宁阳县,经粪便检查,华支睾吸虫虫卵阳性     

华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验

目的 研制华支睾吸虫病金标快速免疫诊断试剂盒，评价其敏感性、特异性和现场试用效果。方法 以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶(PGK)作为诊断试剂，制备胶体金免疫层析检测(Immunochromatography test，ICT)试剂盒，检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫IgG，并与常规ELISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。结果 实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的IgG，3种抗原的敏感性均为100％。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外，与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液，总符合率为92．31％；ICT与ELISA血清检测的总符合率为81．54％。现场获取了9人的粪便样本，其中4人检出华支睾吸虫卵，其血清ICT和ELISA检测均呈强阳性，另外未检出虫卵的5人中，1人血清ICT和ELISA均呈阳性，另1人仅血清ELISA呈弱阳性。结论 诊断华支睾吸虫感染的ICT抗体检测技术，尤其是无创性唾液检测技术，简便、快速、准确、安全，优于血清ELISA检测和粪便虫卵检测，适用于临床检验和现场大规模流行病学调查。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

东方次睾吸虫与华支睾吸虫病原形态鉴别比较

目的通过对东方次睾吸虫(Metorchis odentalis)与华支睾吸虫(Clonorchis sinenais)的各期病原体形态的观察比较,为鉴别该病种提供科学依据。方法收集两种吸虫的成虫、虫卵和囊蚴,并进行形态学比较、大小测量和寄生宿主部位的观察。结果东方次睾吸虫和华支睾吸虫成虫寄生部位均为肝胆管与胆囊。幼虫囊蚴的寄生部位,华支睾吸虫主要寄生于鱼背鳍肌肉内;东方次睾吸虫囊蚴主要寄生于鱼尾鳍肌肉内。虫卵特征,东方次睾吸虫与华支睾吸虫的虫卵大小与形态极为相似,仅前者卵盖与肩峰不如后者明显,卵壳与光洁度较后者更光滑透亮。囊蚴特征:东方次睾吸虫囊壁较华支睾吸虫为厚,且成双层结构,为典型的特征性。成虫特征:华支睾吸虫虫体呈葵花仔状,东方次睾吸虫则呈叶片状。结论发现虫卵、囊蚴与成虫时,需根据形态和大小等特征加以鉴别。     

亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴,接种动物,收集成虫,制备匀浆液(粗抗原),借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱,提取特异性抗原,用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(CG-PAGE)和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CG-PAGE显示5条蛋白带,免疫印迹试验鉴定均有抗原性,强阳性带蛋白分子质量单位为31ku,各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

广西贵港市2 175例华支睾吸虫病住院病例分析

目的 了解广西贵港市华支睾吸虫病住院病例流行病学分布特点，为控制该病流行提供参考。 方法 1985-2007年采集每例患者新鲜粪便30～50 g, 用水洗自然沉淀集卵法检查虫卵确诊。在虫卵阳性者中随机抽取61例，用Stoll法计数克粪虫卵数（EPG）, 划分感染度。EPG≤500为轻度感染，501～5 000为中度感染，＞5 000为重度感染。 结果 确诊华支睾吸虫病患者2 175例, 其中有合并症者1 244例占57.2%。中、重度感染占55.7%(34/61)。EPG平均为3 055。农村1 430例，其中890例(占62.2%)分布在23乡(镇)(主要在三里镇、石卡镇)及1个农场[占总乡(镇)和农场数的80%(24/30)]。患者年龄为3～76岁，其中以20～49岁青壮年为主。男女比例为3.6 ∶ 1, 农民990例占45.5%, 壮族1 308例占60.1%。患者就医人数各阶段年度构成比呈逐渐上升趋势。有明确食鱼生史者1 435例占66.0%。 结论 贵港市华支睾吸虫病流行广泛，就医人数年度构成比呈上升趋势。     

肝吸虫感染大鼠模型的建立及肝损伤的观察

目的 观察不同剂量的肝吸虫囊蚴感染大鼠后粪便中虫卵检出率及肝组织的病理变化.方法 分离采自疫区麦穗鱼体内的囊蚴,分别以25、50、100和200个囊蚴经口感染四组大鼠,同时设生理盐水灌注对照组.生理盐水涂片法检查大鼠粪便中虫卵,虫卵检出率达100％时宰杀动物,取肝脏制备组织切片.结果 成功建立了肝吸虫感染Wistar大鼠的实验动物模型,观察到肝吸虫感染大鼠和肝吸虫病患者肝组织有典型的肝胆管病理学改变.感染组大鼠感染后3w粪便虫卵检出率为70.8％;感染后4w为85.4％;感染后5w为93.8％;感染后6w检出率为100％.感染25个囊蚴组虫体回收率为17.3％;感染50个囊蚴组虫体回收率为15.7％;感染100个囊蚴组虫体回收率为42.8％;感染200个囊蚴组虫体回收率为31.7％.对照组均未检出虫卵及成虫.结论 感染后6w肝吸虫虫卵的检出率达高峰;感染100个囊蚴组虫体回收率最高.肝吸虫感染可以引起宿主肝细胞变性和坏死,是患者的临床表现及肝损伤的病理基础.     

华支睾吸虫来源极性差异化合物的高效薄层色谱免疫分析

目的探索华支睾吸虫ESPs、虫卵和虫体水溶性组分中生物大分子极性和抗原性的差异并寻找可行的分离方法。方法用HPTLC法分离华支睾吸虫ESPs、虫卵和虫体的水溶性组分,同时结合免疫染色法研究极性差异组分的抗原性。结果用有机溶剂组合可将ESPs、虫卵和虫体水溶性组分中极性强弱差异的化合物分离开。氯仿︰甲醇︰水（11︰9︰2）溶剂组合对弱极性化合物各组分有较好的分离效果。与虫卵相比较,ESPs和虫体的弱极性组分较复杂。不能被有机溶剂展开的强极性组分的抗原性较强,未检测出弱极性组分的抗原性反应。通过有机溶剂提取的弱极性组分可完全在水中复溶并被有机溶剂重新展开。结论华支睾吸虫来源的水溶性组分中的弱极性化合物成分能通过有机溶剂组合进行有效分离。这为分离华支睾吸虫来源的脂类等弱极性生物大分子以及研究其病原相关分子模式的性质奠定了基础。     

华支睾吸虫生活史在实验室的建立

目的 构建华支睾吸虫生活史的室内生态系统。 方法 解剖自然感染华支睾吸虫的家猫,收集华支睾吸虫虫卵,放入养殖缸内自然感染纹沼螺和长角涵螺,待尾蚴发育成熟,分离阳性螺,放入养殖缸内与各种鱼类同缸饲养,使阳性螺释放的尾蚴自然感染缸内的各种鱼类。螺类释放尾蚴后的第30天开始,定时检查鱼类的感染情况,分别采用鱼肉压片法和消化法检查各种鱼体内的感染率和感染度。分离、收集鱼肉中囊蚴感染家猫和SD大鼠。 结果 水温在24.3～37.2 ℃时,尾蚴发育成熟逸出螺体的时间需95 d。纹沼螺的感染率为12.5%（25/200）,长角涵螺为18%（9/50）。水温在20 ℃以下时,螺体内尾蚴停止逸出。鱼类感染尾蚴后形成囊蚴的时间为30 d,至囊蚴完全成熟需45 d。麦穗鱼、草鱼、鳑鮍鱼、鳙鱼、鲮鱼、鲫鱼、鲤鱼和罗非鱼体内囊蚴的感染度不尽相同,每克鱼肉含囊蚴数分别为1 792、16、8、6、5、4、4和2个。将鱼体内分离的囊蚴分别感染大鼠和家猫均获得成虫。 结论 华支睾吸虫生活史室内生态系统构建成功。     

虫卵ITS-2序列分析鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的研究

目的建立以分子生物学技术为基础的华支睾吸虫与扇棘单睾吸虫的ITS-2序列分析鉴别方法。方法在华支睾吸虫流行区采集华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫成虫,从成虫虫体分离并收集虫卵。以蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫做对照虫种,按不同虫种和虫卵数分成5个实验组,各组分别提取DNA,并扩增ITS-2序列,对扩增产物进行测序并作同源性分析以确保为目标片段,根据PCR扩增产物电泳获得的条带判定虫种。结果以华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫虫卵DNA为模板的PCR产物电泳图谱分别在400bp、500bp左右各显示一条明显条带;在以两种虫卵DNA混合液为模板的PCR产物中,电泳图谱在400bp左右和500bp左右各显示明显条带。将测序得到的两种核苷酸序列进行Blast比对后,显示与GenBank中相应的华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫序列高度同源。混入四种肠道线虫虫卵DNA的PCR产物中,除目的条带外,无其他条带。结论该方法可以对华支睾吸虫及扇棘单睾吸虫虫卵进行鉴别,且结果不受常见四种肠道线虫虫卵干扰,敏感性和特异性较高,可作为两虫种的鉴别检测方法。     

广西人体华支睾吸虫感染现状调查分析

目的了解广西人群华支睾吸虫病流行现状和态势。方法按流行程度和水系流域进行分层整群随机抽样。用改良加藤厚涂片法粪检虫卵并计数。结果调查了9个县(市)27个点13990人,华支睾吸虫平均感染率为9.76%,平均EPG为1083,有6个县(市)查出感染者,其中3个县感染率超过20%。男性平均感染率和EPG分别为13.09%和1320;女性分别为5.89%和658,差异均有显著性。各年龄组人群均有感染,以成人感染为重。蒙古族居民感染率最高,为16.67%;汉族感染率为11.56%,高于壮族的8.17%;壮族感染者EPG最高,为1470。职业分布以医生、教师、农民和行政干部感染为重。结论1989年以来广西华支睾吸虫感染率显著上升,疫情快速蔓延,已经成为一个严重的公共卫生问题,应积极开展综合性防治工作。     

华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA内转录间隔区序列分析

目的 通过PCR方法扩增华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA （ribosomal DNA,rDNA）内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列进行分析,探讨其用于华支睾吸虫感染检测的价值. 方法 提取2例华支睾吸虫患者粪便中的虫卵DNA作模板,以rDNA ITS基因片段为目的片段进行PCR扩增,对扩增片段进行测序分析. 结果 从2例患者粪便虫卵样本中均扩增出1 123 bp的条带,经序列比对确定患者粪便中的虫卵为华支睾吸虫卵.测序分析发现本研究的两个样本与中国黑龙江分离株（KF740425）相似性为100％. 结论 本研究从2例华支睾吸虫病患者粪便虫卵中成功扩增出rDNA ITS基因,为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了资料.     

华支睾吸虫卵与灵芝孢子的鉴别

在近几年的粪便常规检验中,常发现有一种酷似华支睾吸虫卵样物质,给实验室诊断带来不便。该文通过对患者服药后粪便涂片、灵芝类药物研碎后的生理盐水涂片及寄生虫学教研室保存的华支睾吸虫卵标本涂片的对比研究,总结出华支睾吸虫卵与灵芝孢子的鉴别要点。     

保护性免疫大鼠感染华支睾吸虫后吡喹酮化疗效果

[目的 ]研究吡喹酮与宿主保护性免疫对华支睾吸虫感染的协同作用。 [方法 ]用粗成虫抗原 (AWAg)和排泄分泌抗原 (ESAg)免疫大鼠或感染 2 0条华支睾吸虫囊蚴获得保护性免疫 ,用 5 0个华支睾吸虫囊蚴感染大鼠 ,用亚致死量吡喹酮(5 0 mg/ kg)治疗 ,以回收虫体数观察疗效。统计学上显著性差异用 PC- SAS系统的 ANOVA和 Nparlway Kruskal- Wallis检验法。 [结果 ]1在对照组 ,ESAg免疫接种组和 AWAg免疫接种组吡喹酮杀幼虫效果明显高于成虫 ,3组均为 P<0 .0 1。2感染后的减虫率 ,与对照组比较 ,ESAg免疫接种组 (35 .6 % ,P<0 .0 1)和华支睾吸虫囊蚴感染组 (97.5 % ,P<0 .0 1)较高 ,而在 AWAg免疫接种组 (2 3.4% )较低。吡喹酮的疗效在 ESAg免疫接种组显著增高。 [结论 ]吡喹酮对华支睾吸虫的疗效在大鼠具有获得性免疫的情况下相协性的提高。