母胎间差异甲基化片段在无创性产前诊断中的应用价值

目的探讨HLCS、RASSF1A片段在母胎间甲基化状态的差异并评估其在无创性产前诊断中的应用价值。方法收集388例孕妇血浆,其中126例同时收集外周血细胞及胎盘（或绒毛）组织,采用甲基化敏感性限制性酶切联合荧光定量PCR（MSRE＋PCR）技术,检测母胎间HLCS基因、RASSF1A基因甲基化状态的差异,分析其影响因素,并根据孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A浓度比值判断胎儿21号染色体数目。结果研究证实HLCS及RASSF1A在胎盘或绒毛组织中均呈高甲基化状态,而在母体外周血细胞呈现低甲基化状态,且这种甲基化差异不受孕妇年龄、孕周、胎儿性别的影响。采用MSRE＋PCR技术对孕妇血浆中HLCS、RASSF1A片段的检出率分别为97.4%和96.9%。计算274例正常妊娠孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A比值,确定其95%的参考值范围为0.34～2.02,以此为标准判断102例胎儿21号染色体数目,其中98例二倍体妊娠的准确率为95.9%（94/98）,4例21三体综合征妊娠均获正确诊断。结论高甲基化HLCS、RASSF1A基因可作为孕妇血浆中胎源DNA的标志物,且有望根据孕妇血浆中甲基化HLCS/RASSF1A浓度比值进行21三体综合征的无创性产前诊断。     

应用QF-PCR技术研究孕妇血浆中胎儿游离DNA与染色体非整倍体妊娠的关系

目的孕21三体胎儿孕妇血浆中胎儿游离DNA水平明显高于正常孕妇,该研究旨在评价妊娠时期孕妇血浆中胎儿游离DNA作为筛查唐氏综合征指标的意义及可行性。方法应用荧光定量PCR技术(QF-PCR)检测怀孕唐氏综合征男胎孕妇和孕正常男胎孕妇血清中胎儿游离DNA的水平。15例孕唐氏综合征男胎孕妇和25例孕正常男胎孕妇及10例孕正常女胎孕妇参与该项研究。结果孕唐氏综合征孕妇血清中胎儿游离DNA水平为185.8基因当量/ml,明显高于正常组(81.9基因当量/ml),P=0.005。结论孕唐氏综合征男胎孕妇血清中胎儿游离DNA含量明显高于正常组,提示荧光定量PCR技术检测孕期母血中胎儿游离DNA水平可能成为筛查唐氏综合征的一个有效指标。     

产前筛查母血游离胎儿DNA在21-三体、18-三体中的应用及在优生中的价值

目的分析产前筛查母血游离胎儿DNA在21-三体、18-三体胎儿产前筛查中的灵敏度、特异度和准确度,为寻找简便、快捷、准确的产前非整倍体异常胎儿筛查方法的选择提供参考,以期提升优生率。方法选择2014年2月-2016年1月在我院行产前健康检查中274例孕中期非整倍体异常高危妊娠妇女作为研究对象。所有孕妇均取外周血行胎儿基因测序,并与人正常基因组进行对比,检出非整倍体异常胎儿;所有孕妇均行羊膜腔穿刺,取羊水行核酸DNA检测。随访所有未行妊娠终止的孕妇出生胎儿21-三体、18-三体异常情况,综合羊水核酸DNA检测结果及出生后胎儿基因检测结果为金标准,计算孕妇外周血游离胎儿DNA检测21三体、18三体的灵敏度、特异度、准确度。结果 274例12-三体、18-三体异常高危孕妇经羊膜腔穿刺羊水遗传学检测出21-三体阳性14例,18=三体阳性7例。母血游离DNA检测出21-三体阳性14例,18-三体阳性6例。母血游离胎儿DNA检测费整倍体异常的灵敏度、特异度、准确度分别为:98.42%、76.19%96.72%。274例羊膜腔穿刺羊水遗传学检测孕妇中,12例行二次穿刺取羊水,1例出现羊膜腔感染而流产,1例出现出血流产。母血游离胎儿DNA检测未对母儿产生不良反应。结论母血游离胎儿DNA产前检测可有效筛查出21-三体、18-三体非整倍体异常胎儿,安全,准确度高,及早采取措施终止妊娠,避免DNA缺陷儿的出生,对促进优生有较高的临床价值。     

孕妇外周血中RASSF1A基因甲基化状态研究

目的探讨RASSF1A基因作为孕妇外周血中胎儿特异性标记物的可行性。方法随机选取43例的外周血样本,其中妊娠晚期孕妇标本40例、健康未妊娠女性标本3例,以及早期妊娠行流产的绒毛组织样本5例。利用甲基化敏感限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)及荧光定量PCR的方法,检测血细胞、绒毛和血浆DNA的RASSF1A基因甲基化状态。结果健康未妊娠妇女血浆及孕妇血细胞中均未检出甲基化RASSF1A基因;绒毛组织中甲基化RASSF1A基因检出率为100%;孕妇血浆中甲基化RASSF1A基因检出率为92.5%。妊娠晚期孕妇血浆RASSF1A基因含量Ct平均值为30.43±2.37。结论在母体和胎儿DNA中,RASSF1A基因甲基化状态有明显差异,用实时荧光定量PCR可对孕妇血浆RASSF1A基因进行定量,提示了RASSF1A基因是无创产前诊断的一个潜在标记物。     

妊娠各期母血中胎儿RASSF1A基因含量的测定

目的本文旨在分析确定妊娠早、中、晚各期母血中胎儿DNA的含量,从而为利用孕母血浆循环DNA进行病理性妊娠诊断研究奠定基础。方法收集746例不同孕期孕妇抗凝血,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术测定高甲基化RASSF1A基因含量,确定不同孕期孕周孕妇外周血浆中胎儿DNA含量。结果孕妇早、中、晚期孕组血浆胎儿DNA平均含量分别34.68±24.76copies/μL、204.03±124.91copies/μL、338.84±345.15 copies/μL,三组比较有显著性差异(P0.05)。孕妇血浆中的高甲基化RASSF1A水平随着孕周的增长而增高。最早可在7周检测到孕妇血浆中高甲基化RASSF1A基因,含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后三天内消失。10例健康未妊娠女性血浆均未检出高甲基化RASSF1A基因。结论用实时荧光定量PCR的方法可确定正常孕妇血浆中不同孕期孕周胎儿DNA的含量,为后续病理性妊娠诊断研究提供实验依据。     

NIPT-plus在产前筛查中的应用研究

目的探讨应用孕妇血浆中游离胎儿DNA高通量基因测序技术在无创性产前筛查中的临床应用及价值。方法选取2016年8月至2017年1月在洛阳市妇女儿童医疗保健中心因血清学产前筛查高风险、血清学筛查临界风险、高龄及超声软指标异常的孕妇780例行无创胎儿染色体非整倍体基因检测,对于无创阳性孕妇抽取羊水细胞进行染色体核型分析。结果780例孕妇中游离胎儿DNA高通量基因测序技术检测出12例染色体高风险胎儿,羊水核型分析证实其中9例为染色体异常,分别为5例21-三体、1例18-三体及3例性染色体非整倍体。21-三体检出率为100%,18-三体检出率为100%,性染色体非整倍体的检出率为60%。结论无创产前基因检测技术是一种筛查胎儿染色体非整倍体的有效方法,其在胎儿染色体异常疾病的产前检测中具有广泛的应用前景。     

手术终止妊娠对早孕妇女外周血中游离胎儿DNA的影响

目的检测在孕早期手术终止妊娠是否会对母体外周血浆中的胎儿DNA水平造成影响。方法选择孕6~9w妇女36例(自愿要求终止妊娠,无禁忌症,胎儿性别为男性),在其终止妊娠前后分别采取外周静脉血5m l,对其血浆中的游离胎儿DNA的SRY基因行荧光定量分析。结果在36例血浆标本中,术前有31例检测到胎儿DNA,术后全部检测到胎儿DNA。其浓度平均分别为62.40±21.70(31.80~128.00Eq/m l),101.04±37.40(58.20~209.70Eq/m l),术前与术后胎儿DNA含量有统计学差异(P<0.01)。结论①孕妇外周血中游离胎儿DNA最早在孕45天即可检测到。②外周血中游离胎儿DNA的水平在妊娠终止后很快升高。③孕妇外周血中的游离胎儿DNA很可能来源于母胎之间出血。     

无创性产前基因检测技术在未行血清学筛查的高龄孕妇中的应用

目的探讨应用无创性产前基因检测技术对孕妇血浆胎儿游离DNA进行染色体拷贝数检测的可行性。方法选择2011年10月至2015年8月于佛山市妇幼保健院行无创性产前基因检测的730例高龄孕妇(年龄≥35岁),孕周:12-24周,年龄:35-41岁,均为单胎。对无创性产前基因检测结果阳性的孕妇行羊膜腔穿刺或脐静脉血穿刺,行常规染色体核型分析和/或基因芯片检测。对所有高龄孕妇行电话随访,统计分析无创性产前基因检测的准确性。结果 730例孕妇中,母体血浆胎儿游离DNA产前基因检测技术发现21例胎儿染色体拷贝数异常者。其中15例通过羊膜腔穿刺或脐静脉血穿刺行有创性产前诊断,检出21三体7例,45,X[7]/46,i(X)(q10)[23]和45X[13]/46,XX[37]各1例,47,XXX1例,13号染色体微缺失1例,无一例假阴性。无创性非整倍体检测对常见染色体非整倍体的检出率100%,灵敏度100%,特异度99.43%,假阳性率0.57%,假阴性率为0,阳性预测值73.33%。结论无创性产前基因检测技术用于高龄孕妇检测胎儿染色体拷贝数异常具有高度敏感性和特异性优点,假阳性率很低,在对高龄孕妇的胎儿染色体拷贝数变异的产前检测中具有广泛的应用前景。     

2433例孕妇血浆胎儿游离DNA无创性产前非整倍性检测结果分析

目的探讨应用高通量测序技术对孕妇血浆胎儿游离DNA进行无创性胎儿染色体非整倍性检测的准确性。方法选择2011年10月至2013年9月于佛山市妇幼保健院行无创性非整倍性产前基因检测的2433例名孕妇,孕周12-24w,均为单胎,年龄21-41岁。对无创性非整倍性筛查高风险的孕妇行羊膜腔穿刺或脐静脉血穿刺,行常规染色体核型分析。对筛查结果低风险者行电话随访其胎儿出生后情况,统计分析无创性产前非整倍性检测的准确性。结果2433例孕妇中,母体血浆胎儿游离DNA高通量测序技术检测出42例胎儿染色体非整倍性高风险。其中33例通过羊膜腔穿刺或脐静脉血穿刺对比分析,27例21三体高风险者行有创性产前诊断,26例为47,XN,＋21,l例为46,XN。2例18三体高风险者行进一步确诊,其中1例为47,XN,＋18,1例为46,XN。2例i3三体高风险孕妇结果均与穿刺结果为46,XN。1例XO高风险孕妇与穿刺结果为45X[25]／46,XX[25]。1例XXY高风险孕妇结果为47,XXY。孕妇血浆中游离胎儿DNA检测结果阴性者2391例,经电话随访有效者2145例,截止至2014年4月30日,已出生的新生儿均未发现唐氏综合征患儿。无创性非整倍体检测对常见染色体非整倍体的检出率100％,灵敏废100％,特异度99.8,假阳性率0.33％,假阴性率为0,阳性预测值87.9％。结论应用高通量测序技术在染色体非整倍性无创性检测具有很高的灵敏性,假阳性率很低,在胎儿染色体非整倍性疾病的产前检测中具有广泛的应用前景。     

孕妇外周血中胎儿游离DNA在无创产前唐氏综合征诊断的应用探讨

目的探讨孕妇外周血中胎儿游离DNA(cff DNA)在临床无创产前唐氏综合征(21-三体)诊断中的应用。方法收集1735例孕12-24w的单胎孕妇外周血,抽提外周血DNA,利用新一代高通量测序技术进行检测和生物信息学分析,并对21-三体高风险孕妇选择羊水或脐带血染色体核型分析进行对照。结果 1735例标本中新型无创产前技术检测到21-三体阳性样本12例,经染色体核型分析确诊12例,无创产前技术对21-三体检测的灵敏度和特异度均为100%。结论 cff DNA进行临床无创产前21-三体诊断在产前筛查中具有广泛的应用前景。     

唐氏综合征血清学筛查联合无创基因检测技术的临床研究

目的探讨唐氏综合征血清学筛查联合无创基因检测技术在增加唐氏综合征的检出率,降低假阳性率的意义。方法应用时间分辨荧光免疫分析技术,对11 748例孕妇进行血清标志物（PAPP-A/freeβ-h CG或者AFP/freeβ-h CG/u E3）联合筛查,使用Multical软件筛查高风险对象,血清学高风险孕妇抽取静脉血10ml,提取游离DNA,采用新一代高通量测序技术,结合生物信息分析,得出胎儿唐氏综合征的风险率。结果共筛查出高风险孕妇1024例,其中21三体高风险891例,18三体高风险133例,无创基因检测21三体高风险13例,18三体高风险4例,16例高风险孕妇经介入性产前诊断细胞培养均确诊为染色体异常,1例高风险孕妇染色体核型正常。结论无创基因检测在临床工作中可以改善血清学筛查结局,可以在临床工作中建立一套快速无创性产前诊断的有效模式。     

Prenatal assessment of fetal chromosomal and genetic disorders through maternal plasma DNA analysis

The existence of cell free DNA derived from the fetus in the plasma of pregnant women was first demonstrated in 1997. This discovery offered the possibility of non-invasive sampling of fetal genetic material simply through the collection of a maternal blood sample. Such cell free fetal DNA molecules in the maternal circulation have subsequently been shown to originate from the placenta and could be detected from about 7 weeks of gestation. It has been shown that cell free fetal DNA analysis could offer highly accurate assessment of fetal genotype and chromosomal makeup for some applications. Thus, cell free fetal DNA analysis has been incorporated as a part of prenatal screening programs for the prenatal management of sex-linked and sex-associated diseases, rhesus D incompatibility as well as the prenatal detection of Down's syndrome.Cell free fetal DNA analysis may lead to a change in the way prenatal assessments are made.     

正常整倍体及21三体胎盘组织的甲基化标志物研究

 目的：联合应用甲基化特异性多重连接依赖的探针扩增技术（MS-MLPA）及亚硫酸氢盐测序2种方法进行胎盘组织甲基化研究,以寻找可用于无创性产前诊断21三体综合征的甲基化标志物。方法：用MS-MLPA和亚硫酸氢盐测序2种方法对15例正常整倍体孕妇和11例21三体孕妇的胎盘组织,以及13例非孕妇女外周血进行甲基化检测,并计算候选的3个基因（4个位点）CGI149、CGI045、HLCS-1和HLCS-2的甲基化率。结果：（1）MS-MLPA与亚硫酸氢盐测序所测得的甲基化率一致。（2）所选的4个位点,在13例非孕妇女外周血样本中CGI149、CGI045和HLCS-2三个位点均未甲基化;在15例整倍体胎盘中,CGI149有13例（2例未甲基化）、CGI045有11例（4例未甲基化）、HLCS（包括HLCS-1和HLCS-2）有15例甲基化;在11例21三体胎盘中,CGI149有10例（1例未甲基化）、CGI045及HLCS（包括HLCS-1和HLCS-2）均有11例甲基化。只有HLCS-2符合在所有外周血细胞中均未甲基化,在所有胎盘组织中均甲基化。比较4个位点的甲基化率在正常整倍体胎盘与21三体胎盘的不同,只有CGI149有统计学意义,其它3个位点（CGI045、HLCS-1和HLCS-2）均无统计学意义。结论：（1）MS-MLPA可代替亚硫酸氢盐测序用于胎盘的甲基化研究。（2）本研究所选择的CGI045、CGI149、HLCS-1和HLCS-2不适合用作21三体的甲基化标志物,需进一步寻找新的位点。     

用改良绝对定量法检测正常孕妇与妊娠21三体胎儿孕妇外周血游离核酸浓度

目的运用一种改良的绝对定量PCR法比较分析正常孕妇组与妊娠21-三体孕妇组外周血中游离PLAC4-DNA浓度的变化;方法采用长片段扩增子代替质粒构建标准曲线,根据生成的标准曲线方程计算出两组孕妇外周血中游离PLAC4-DNA的浓度值,经两独立样本t检验分析两组结果差异;结果长片段扩增子构建的标准曲线方程：Y=-3．334X＋43．438,R^2=0．996,Eft％：99．478％。根据标准曲线方程得出,300例正常孕妇组PLAC4平均浓度：58．4copies／μl,20例妊娠21三体孕妇组平均浓度：62．6copies／μl,,经两独立样本t检验,P=0．439;结论改良的长片段扩增子构建标准曲线具有操作简便,成本低,准确性高的优点,可为绝对定量提供-种经济简便且有效的参考方法。通过绝对定量法检测得出正常组孕妇与妊娠21-三体孕妇组外周血中总的游离PLAC4-DNA的变化无统计学差异。     

The CpG island of the FMR-1 gene is methylated differently among embryonic tissues: implication for prenatal diagnosis

We studied the methylation status of the CpG island of the FMR-1(fragile X syndrome) gene to recognize the possibility of itsprenatal diagnosis with early pregnant subjects. Southern hybridizationusing EcoRI/BssHII restriction enzymes double digestion wasperformed in the brain and chorionic villi of 8th week embryos,and the placenta and cord blood of newborns. No methylationof the FMR-1 gene occurred in both of the tissues examined inmales, while 50% of the cells in females were methylated inboth the brain and the cord blood, indicating that methylationoccurs with inactivation of the X-chromosome in accordance withthe literature. However, there was no methylation in eitherthe chorionic villi or placenta in female as well as in males.Some extra-embryonic tissues such as the chorionic villi andthe placenta escape X-chromosome FMR-1 gene inactivation andit can be the exception in the lyonization. To assess the methylationstatus in prenatal diagnosis, precautions are needed and theyare not suitable for prenatal diagnosis.     

怀化地区7859例孕中期唐氏筛查和产前诊断结果分析

目的探讨孕中期唐氏筛查和产前诊断对检出胎儿染色体异常和妊娠不良结局的临床价值。方法应用时间分辨荧光免疫法对7859例孕中期(14-20周)妇女进行血清标记物三联方案(hA;FP+free-β-hCG+uE3)检测。筛查结果应用Multical软件计算21三体、18三体综合征和开放性神经管畸形的风险(rish)概率。对于高风险孕妇经遗传咨询,知情同意,自愿选择行产前诊断,于孕18-24周左右在超声引导下进行羊膜腔穿刺,抽取羊水培养进行胎儿染色体核型分析。并继续追踪胎儿和孕妇情况。结果在7859例孕妇中,筛查到高风险732例,唐氏筛查阳性率为7.65%(601/7859)。其中367例接受羊水或脐血穿刺产前诊断,占筛查高风险孕妇的50.13%(367/732);发现胎儿染色体异常16例,异常检出率4.36(16/367),其中6例唐氏综合征、5例18-三体综合征、4例Turner’s综合征、1例9号染色体臂间倒位。唐氏筛查高风险和低风险组不良妊娠结局分别为6.15%和1.46%,呈显著性差异(<0.05)。结论孕中期产前筛查是预测异常胎儿和不良妊娠结局的有效指标。结合羊水培养或脐血培养等产前诊断技术和方法,对预防先天缺陷儿出生、提高人口素质有重要临床应用价值。     

5933例孕中期母血清产前筛查回顾性分析与诊断

目的探讨孕中期母血清三联筛查法的临床意义及了解枣庄地区21-三体综合征（唐氏综合症）、18-三体综合征及NTD（神经管畸形）的发病率,旨在促进枣庄市产前筛查工作的更好开展。方法采用时间分辨荧光免疫分析法（DELFIA）对枣庄市产前诊断中心自2012年10月至2013年10月采集的5933个标本进行三联法孕中期母血清产前筛查。结果5933例孕妇中446例高风险,总体高风险率是7.5%;其中21-三体综合征高风险324例,高风险率是5.5%;18-三体高风险101例,高风险率是1.7%;NTD高风险21例,高风险率是0.4%。在自愿以及知情基础上经遗传咨询后有164例高风险孕妇行产前诊断,共确诊8例,确诊率是4.8%,其中21三体综合征4例,NTD 2例,畸胎瘤1例,三X综合征1例。结论结果表明孕中期母血清三联筛查法对于预测胎儿染色体病具有重要临床价值,可有效降低新生儿出生缺陷的发生;扩大产筛覆盖率,对实施出生干预工程,提高出生人口素质有重大意义。     

广东地区近年产前诊断中常染色体三体检出率的分析

目的探讨广东地区近年在产前诊断中常染色体三体检出率的变化情况和原因。方法对2005年至2007年和2008年至2010年两个时间段因各种产前诊断指征在本院行胎儿染色体核型分析的病例的常染色体三体检出率进行比较。结果在产前诊断中21-三体、18-三体和13-三体是最常见的常染色体三体;2008年至2010年的常染色体三体总检出率和高龄孕妇比例比2005年至2007年提高;两个时间组非高龄孕妇妊娠常染色体三体儿几率均高于高龄孕妇。结论广东地区近年产前诊断常染色体三体总检出率的提高与孕妇高龄化、环境污染、孕期血清学筛查和超声检查的广泛应用有关,提高医务人员的检验水平和保护环境有助于减少常染色体三体儿的出生。     

南宁地区1790例高龄孕妇妊娠中晚期胎儿染色体核型分析

目的通过对高龄孕妇的羊水、脐带血进行培养及核型分析来探讨高龄孕妇所孕胎儿染色体异常情况及三体发生率与年龄的相关性,为遗传咨询和产前诊断提供理论依据。方法通过对2010年至2011年,两年间在我院遗传门诊就诊的1790例高龄(≥35周岁)孕妇进行羊膜腔穿刺或脐带血管穿刺,抽取羊水及脐带血做细胞培养,观察培养情况,并进行核型分析。分析高龄孕妇染色体异常核型检出情况。结果 1790例高龄孕妇中共检出核型异常158例,异常检出率为8.82%。在不同年龄组,35-37岁,38-40岁,≥41岁三体发病率分别为1.06%,1.42%,2.08%。结论高龄孕妇随年龄增长染色体异常几率增加,高龄孕妇有必要行产前诊断。     

无创性产前基因测序技术在染色体非整倍体中的应用

目的探讨高通量并行测序技术在胎儿染色体非整倍体检测中的应用价值。方法2012年10月至2013年4月,生化血清学筛查唐氏高危或高龄孕妇,采用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行无创性产前检测,评估患病风险率,提示高危孕妇进行核型分析确诊。结果813例无创检测高危孕妇,13例提示异常高危,异常率为1．59％,其中4例21三体,3例18三体,6例性染色体。核型确诊4例均为21三体,准确度100％;2例18三体;1例47,XXY和1例47,XXX。结论基于高通量测序技术的方法能快速、准确、无创检测唐氏综合征,相对18三体和性染色体检测准确度和稳定性有待优化与提高。