Grp78表达对人肝细胞癌细胞外信号调节激酶1/2活性和表达的影响

目的 通过检测葡萄糖调节蛋白78(Grp78)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2在肝细胞癌手术切除组织中的表达,并在SMMC-7721细胞中干预Grp78的表达,探讨Grp78对ERK1/2激酶的调控作用。 方法 应用免疫组织化学方法（IHC）和免疫印迹法检测47例肝细胞癌手术切除组织样本中Grp78,ERK1/2的表达和ERK1/2磷酸化水平;在高表达Grp78的肝细胞癌细胞系SMMC-7721中,通过用小RNA干扰Grp78的表达来探讨Grp78表达水平,改变对ERK1/2活性及表达的影响。 结果 在肝细胞癌组织样本中,Grp78的表达情况与ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达明显呈正相关。在SMMC-7721细胞中Grp78高表达促进ERK1/2的磷酸化,应用RNA干扰特异性下调Grp78高表达细胞中Grp78水平可以抑制ERK1/2的磷酸化。 结论 Grp78参与调解ERK1/2信号通路,并且在肝细胞癌临床治疗方面可能成为潜在的治疗靶点。     

应用RNAi抑制细胞中绿色荧光蛋白的表达

目的 在293T和Mel细胞中研究RNA干扰（RNA interference，RNAi）对绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）表达的沉默作用。方法 以巢式PCR方法从人胚肾293T细胞中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，并用于驱动RNAi片段的合成；构建能抑制eGFP特异性表达的RNAi载体（TRl）。将eGFP载体和RNAi干扰载体共转染293T和Mel两类细胞中，应用荧光显微镜观察、逆转录-PCR、荧光辅助细胞分选技术和定量逆转录-PCR方法分析上述细胞中RNAi对eGFP表达的抑制情况。结果 RNAi载体能有效地使293T和Mel细胞中红系特异的eGFP表达量均降低约50％以上。结论 本文构建的RNAi载体能有效的抑制目的基因eGFP在细胞中的表达。     

沉默葡萄糖调节蛋白78基因增强高氧诱导的肺泡上皮细胞凋亡北大核心CSCD

目的探讨小干扰RNA(siRNA)干扰内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因表达对高氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响及作用机制。方法培养人肺腺癌A549细胞,用构建的siRNA片段通过脂质体LipofectamineTM2000转染A549细胞,将细胞分为高氧空白组、阴性对照(阴性siRNA)组和实验(GRP78-siRNA)组3组,利用950 mL/L O2建立高氧细胞损伤模型。48 h后通过实时定量PCR检测C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA的表达,Western blot技术检测CHOP蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果应用siRNA抑制GRP78表达后,GRP78 mRNA和蛋白表达下调、CHOP mRNA和蛋白表达上调、A549细胞凋亡增加。结论下调GRP78基因可增强高氧活化的CHOP凋亡途径,诱导肺泡上皮细胞凋亡。     

葡萄糖调节蛋白78在宫颈癌细胞衰老过程中的表达研究

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein,GRP78）在顺铂诱导宫颈癌细胞衰老过程中的表达变化情况及相关机制。方法亚凋亡剂量顺铂诱导宫颈癌细胞衰老;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;P1染色流式细胞仪检测细胞周期变化;Western blot检测GRP78蛋白表达情况;siRNA反义抑制GRP78表达,western blot检测DNA损伤修复基因ATM（ataxia—telangiectasia mutated）通路相关基因表达情况。结果亚凋亡计量顺铂能够成功诱导宫颈癌细胞衰老,细胞主要阻滞于G2／M期。Western blot检测表明在宫颈癌细胞衰老过程中GRP78蛋白表达明显降低。反义抑制GRP78蛋白表达后ATM通路相关蛋白P53及p-Cdc2表达明显升高,而Cdc2蛋白表达明显降低。结论GRP78蛋白在顺铂诱导宫颈癌细胞衰老过程中起抵抗作用,主要可能通过影响ATM通路相关基因的表达发挥作用。     

人端粒酶逆转录亚单位特异性siRNA对ES-2细胞生长抑制作用的研究

目的研究人端粒酶逆转录亚单位（hTERT）特异性SiRNA对ES-2细胞体外生长及体内肿瘤形成能力的抑制作用。方法设计并化学合成针对hTERT的8iRNA，用脂质体转染法将其导入ES-2细胞内，通过软琼脂克隆形成实验及肿瘤细胞接种裸鼠的肿瘤形成实验，观察hTERT—siRNA对ES-2细胞体外及体内的生长抑制作用。结果软琼脂克隆形成实验显示，hTERT—siRNA转染的ES-2细胞克隆形成数量明显少于对照组。裸鼠体内实验结果显示，hTERT—siRNA转染组肿瘤生长速度也明显慢于对照组。结论hTERT-siRNA在体内外均可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

背景：一些实验在模型鼠移植瘤中葡萄糖调节蛋白94被敲除后,细胞黏附中断,刺激肝起源细胞增殖,进而促进肝肿瘤的发生,推测葡萄糖调节蛋白94在肝癌中起到保护作用。 目的：应用小干扰RNA技术抑制裸鼠卵巢癌模型皮下移植瘤内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白94的基因表达,探讨移植瘤中葡萄糖调节蛋白94基因及蛋白表达的变化对移植瘤生长的影响。 方法：从GeneBank中选取人类葡萄糖调节蛋白94基因序列,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6 的真核表达载体psiSTRIKETM/葡萄糖调节蛋白94。建立人卵巢癌HO-8910细胞株裸鼠皮下接种模型,并将真核表达载体转染入裸鼠移植瘤体内,观察肿瘤生长情况。卵巢癌裸鼠模型经过不同给药方案干预后分为特异性小干扰RNA组,非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组, RT-PCR和免疫组化SP法检测葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白在肿瘤内的表达情况,并观察模型裸鼠的移植瘤生长情况。 结果与结论：成功构建RNA干扰质粒载体,所有裸鼠模型均接种成功,5 d后即可见皮下肿瘤形成,14 d左右肿瘤直径达7-10 mm。转染质粒完毕后抑瘤率为65.1%,与非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组比较,差异有显著性意义(P < 0.01)。psiSTRIKETM/GRP94治疗后瘤体内葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白显著下调(P < 0.01)。说明靶向葡萄糖调节蛋白94 mRNA的小干扰RNA可显著抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白表达下调所致。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

葡萄糖调节蛋白78促进肝硬化大鼠心肌细胞凋亡及其机制

 目的： 探讨葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白重链结合蛋白(GRP78/BiP)是否促进肝硬化大鼠心肌细胞凋亡及其发生机制。方法： 采用复合致病因素法建立肝硬化大鼠模型,在4周、6周和8周分别取材。实验1：取心脏称重并测量左室壁厚度,计算左室壁厚度与心脏重量比值及心脏指数。实验2： TUNEL法观察心肌细胞凋亡情况;免疫组化方法检测心肌组织中GRP78/BiP蛋白以及凋亡相关蛋白CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白/生长停滞及DNA诱导蛋白153（CHOP/GADD153）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）、核转录因子κB p65（NF-κB p65）、B细胞淋巴瘤/白血病蛋白2（Bcl-2）的表达。结果： 随肝硬化病程进展,左室壁厚度与心脏重量比值以及心脏指数逐渐增加,8周组增加显著(P<0.05);心肌细胞凋亡指数、CHOP/GADD153和caspase-12阳性蛋白表达指数逐渐升高,8周组差异显著(P<0.05);NF-κB p65和Bcl-2阳性蛋白表达指数呈一致性变化,在4周组较其它组明显增高(P<0.05); GRP78/BiP蛋白阳性表达指数与心肌细胞凋亡指数、CHOP/GADD153、caspase-12蛋白阳性表达指数呈显著正相关,CHOP/GADD153与NF-κB p65、Bcl-2蛋白阳性表达指数呈显著负相关。结论： GRP78高表达在内质网应激介导的肝硬化心肌病发病中可能发挥重要作用。     

遗传学研究的新工具:RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是近年来发现的一个新的遗传学现象,近年来在遗传学的研究中已用于基因功能的研究,遗传病的基因治疗等领域,成为遗传学研究的新工具。本文就其在遗传学方面的应用作一综述。     

Cyr61基因siRNA表达载体的构建及沉默作用研究

目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。     

RNA干扰阻抑Bax inhibitor-1(bi-1)基因表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的： 研究RNA干扰(RNAi)效应对人卵巢癌细胞株HO8910PM和HO8910中bi-1基因表达的抑制作用和凋亡诱导作用。 方法： 把表达bi-1 shRNA的各重组干扰质粒转染到HO8910PM和HO8910细胞中,RT-PCR和Western blotting法检测bi-1基因mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和Hoechst 33258/PI荧光染色检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果：与对照组细胞相比较,转染4种候选干扰质粒组细胞中bi-1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降（P<0.05）,以转染pmU6-b4组细胞的表达抑制率最高,在HO8910PM细胞中的抑制率分别为 (45.50±3.04）%和(51.08±4.96）%,在HO8910细胞中的抑制率分别为 (37.29±3.69）%和(44.96±4.28）%;流式细胞术结果表明,与对照组细胞相比较,转染pmU6-b4质粒24 h、48 h、72 h、96 h的HO8910PM细胞中亚二倍体峰比值明显升高 (P<0.05),以转染72 h组细胞的比值最高,达到 (25.89±5.63）%,而HO8910细胞中无亚二倍体峰出现;荧光显微镜下可见转染pmU6-b4质粒72h的HO8910PM细胞出现细胞核缩小、染色质固缩和核断裂,而HO8910细胞核无明显变化。 结论： 针对bi-1的siRNA能特异有效地下调HO8910PM和HO8910细胞中bi-1基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bi-1基因表达的能力不同;瞬时转染质粒pmU6-b4能有效诱导HO8910PM细胞凋亡,但不能诱导HO8910细胞凋亡。     

碱性成纤维细胞生长因子对人卵巢癌CAOV3细胞凋亡及葡萄糖调节蛋白78表达的影响

目的： 研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与人卵巢癌CAOV3细胞凋亡的关系及葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达的变化,探讨bFGF促进人卵巢癌CAOV3细胞增殖,抑制凋亡的信号机制。方法：利用无血清饥饿诱导卵巢癌CAOV3细胞凋亡。分为对照组、bFGF组、PKB抑制剂组。应用流式细胞术、Annexin V/PI双荧光染色法观察bFGF对CAOV3细胞增殖及凋亡的影响。利用Western blotting、RT-PCR检测bFGF对PKB、GRP78表达的影响。结果：bFGF呈剂量依赖性激活PKB信号通路,呈时间依赖性促进GRP78 mRNA及蛋白表达（P＜0.01）。与对照组相比,bFGF可加速CAOV3细胞的细胞周期进程,促进细胞增殖,抑制无血清培养诱导的细胞凋亡。PKB特异性抑制剂wortmannin可阻断bFGF的上述作用。结论：bFGF可能通过PKB信号通路上调GRP78的表达,促进细胞增殖,抑制饥饿诱导的卵巢癌CAOV3细胞凋亡。     

RNA干扰GPC3基因表达影响肝癌细胞Huh-7凋亡的机制研究

目的观察RNA干扰GPC3基因表达对人肝癌细胞Huh-7凋亡的影响,并探讨其初步机制。方法设计并合成靶向GPC3的特异性siRNA片段,通过脂质体转染法瞬时转染肝癌细胞Huh-7,48h后验证siRNA的干扰效率;Annexin V/PI染色法观察GPC3基因沉默对细胞凋亡的影响;通过Western blot和定量PCR来检测caspase3的蛋白水平和核酸水平表达。结果设计合成的GPC3siRNA转染后,能够有效抑制Huh-7细胞中GPC3的表达;流式细胞仪检测结果显示,GPC3干扰组细胞在转染后48、72h的凋亡率显著高于空白对照组（P〈0.01）,96h后两组凋亡率差异无统计学意义（P〉0.05）。GPC3干扰组的caspase3在转染后48、72h的表达高于未转染组,96h后两组间caspase3水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 siRNA静默GPC3基因能促进肝癌细胞凋亡,其机理可能与上调caspase3有关。进而推测,GPC3基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。     

重组人苗勒抑制物对2株卵巢癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨重组人苗勒抑制物(rhMIS)对人卵巢癌细胞株OVCAR8及SKOV3细胞生长的影响。方法:Western blotting检测细胞中MISII型受体(MISIIR)蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察MISIIR蛋白在细胞中定位。rhMIS分别干预2株卵巢癌细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖变化;软琼脂克隆实验检测细胞体外成瘤性;流式细胞术分析rhMIS对细胞凋亡和细胞周期影响。结果:OVCAR8细胞表达MISIIR蛋白,其定位于细胞表面及细胞质中,SKOV3细胞中MISIIR蛋白表达缺损。经rhMIS作用48h后,OVCAR8细胞的生长速率显著减慢、细胞体外成瘤性明显降低、细胞发生凋亡和G1期细胞增加,rhMIS(10mg/L)干预后细胞凋亡率和G1期细胞比率分别可高达(31.3±2.1)%和(70.4±3.0)%,与SKOV3细胞比较差异显著(P0.01)。结论:重组人苗勒抑制物可以抑制MISIIR蛋白表达的卵巢癌细胞增殖、诱导其凋亡、阻滞细胞周期,这有望成为治疗卵巢癌的一个新靶点。     

干细胞因子表达异常与卵巢低反应发生的相关性研究

目的检测干细胞因子（stem cell factor, SCF）在卵巢低反应患者颗粒细胞的表达和卵泡液中的水平,并探讨其与卵巢低反应发生的相关性。方法对接受体外受精-胚胎移植（In vitro fertilization - embryo transfer, IVF - ET）治疗的25例卵巢低反应患者（A组）及同期27例卵巢反应正常患者（B组）,均行拮抗剂方案促排卵,采用免疫组织化学方法检测颗粒细胞SCF水平。及酶联免疫吸附方法测定卵泡液SCF的水平,比较两组SCF颗粒细胞表达水平及卵泡液水平的差异。结果SCF在两组颗粒细胞中均有表达,卵巢低反应组SCF颗粒细胞表达水平及卵泡液中水平较卵巢反应正常组均显著降低（P〈0．05）。结论SCF可能对卵泡的生长发育起到一定调节作用,其表达降低可能参与了卵巢低反应的发生机制。     

RNA干扰沉默IGF—IR基因治疗卵巢癌的实验研究

目的研究RNA干扰技术沉默IGF—IR在卵巢癌靶向治疗中的意义。方法以IGF—IR为目的基因,设计合成siRNA重组质粒;利用Real—timePCR和Westernblot方法,分别从mRNA水平及蛋白水平检测IGF—IR的表达;通过MTF实验检测细胞增殖情况。结果本实验成功构建了三个表达载体pSihIGF—IR-1、pSihIGF—IR-2和pSihIGF—IR-3,转染卵巢癌OVCAR3细胞,48h后,IGF—IR的mRNA及蛋白水平均明显降低,并且显著抑制了OVCAR3细胞的体外增殖。结论应用RNA干扰技术,能够高效、特异的沉默IGF—IR基因的表达,抑制肿瘤生长。针对卵巢癌IGF—IR的RNAi技术,可能为卵巢癌的临床治疗开拓-条新的途径。     

The expression of IMP3 in 366 cases with ovarian carcinoma of high grade serous,endometrioid and clear cell subtypes

The clear cell (CCC), high grade serous (HGSC) and endometrioid (EC) ovarian carcinomas share overlapping histological features. The oncogene IMP3 is implicated in CCC with an elusive utility in differential diagnosis. We collected 366 cases with ovarian primary carcinomas to detect IMP3, Napsin-A and HNF-1β by immunochemistry. In 351 cases, the positive expression rate of IMP3 in CCC was significantly higher than that either in EC or HGSC (p?<?0.01). The sensitivity of IMP3 in CCC was higher than Napsin-A but lower than HNF-1β (p?<?0.01). The specificity of IMP3 in CCC was lower than Napsin-A but higher than HNF-1β (p?<?0.01). The composite markers Napsin-A+/IMP3+ and the IMP3+/HNF-1β+/Napsin-A+ offered the highest odds ratio (p?<?0.001), the highest specificity, the highest positive predictive value and the highest positive likelihood ratio. The ROC analysis showed that the combination of Napsin-A, HNF-1β and IMP3 offered the biggest AUC compared with either the singular marker performances or the other binary combinations (p?<?0.001). In 15 cases of EC mixed with CCC, IMP3 showed a better discrimination value than the other two markers. Consequently, adding IMP3 to the diagnostic panel might provide some help with the pathological diagnosis of ovarian CCC.     

IVF-ET患者卵巢颗粒细胞COX-2的表达与妊娠结局的相关性研究

目的探讨体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)患者卵巢颗粒细胞中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,分析其与妊娠结局的关系。方法荧光半定量real-time PCR检测48例行IVF-ET患者卵巢颗粒细胞中COX-2的mRNA表达,分析COX-2与注射hCG日血清雌二醇(estradiol,E_2)水平、获卵率、受精率、优质胚胎率及妊娠率的关系。结果卵巢颗粒细胞COX-2的表达量与hCG日血清E_2水平及获卵率无关,与受精率、优质胚胎率及妊娠率相关。结论 PCOS患者卵巢颗粒细胞COX-2的表达与胚胎质量相关,研究卵巢颗粒细胞的COX-2的表达可以作为预测IVF-ET妊娠结局指标之一。