含人组织型纤溶酶原激活剂cDNA重组逆转录病毒的制备及鉴定

将人组织型纤溶酶原激活剂ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ＬＮＳＸ重组后转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，形成完整的重组病毒颗粒，电镜下重组病毒呈散在分布，球形，直径９０～１８０ｎｍ，由囊膜、外壳和核心三部分组成。重组病毒颗粒感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，在含Ｇ４１８培养基中筛选培养２周后计数阳性细胞克隆数，结果达６×１０８ＣＦＵ／Ｌ；被感染的受体细胞ＮＩＨ３Ｔ３高效表达具有纤溶活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂。     

肝癌组织浸液尿激酶型和组织型纤溶酶原激活物的检测

一些研究表明体液中的尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator,u PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物受体 (uokinasetypeplasminogenactivatorreceptor,u PAR )浓度与癌细胞自身分泌和释放的水平及其浸润转移有关 ,而组织型纤溶酶原激活物 (tissueplasminogenactivator,t PA)则与癌组织血管内皮细胞的释放和血管新生有关 ,组织型纤溶酶原激活物抑制剂 (Tissueplasminogenactivatorinhibitor 1,PAI 1)则对t PA和u PA起调控作用 ,同时参与癌细胞的转移等过程[1 ,2 ] 。为探讨癌生长和癌扩散转移及血管新生与上述指标之间的…     

组织型纤溶酶原激活物基因的DNA改组

目的：探索利用DNA改组（DNAshuffling)技术，获得更高活性tPA的可能性。方法：以人，恒河猴及大白鼠tPAcDNA为一组基因，进行tPA的DNA改组（DNAfamily shuffling)。以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选。结果：得到了两株有意义的克隆；t9和t17，其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA，初步的比活性测定结果表明，活性约提高4倍。t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失，但仍表现出与人tPA相同的活性，两株克隆经测序证明，为改组后的基因，其序列以人和恒河猴的tPAcDNA序列为主，少数序列来源于大白鼠tPAcDNA。结论：这一探索性结果将为后续几轮的tPADNA改组探明道路，为最终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础。     

三七总皂甙对急性脑梗死重组组织型纤溶酶原激活物静脉溶栓后缺血再灌注损伤及出血性转化的影响

目的:探讨三七总皂甙(panax notoginseng saponins,PNS)对急性脑梗死重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)静脉溶栓后缺血再灌注损伤及出血性转化(hemorrhagic transformation,HT)的影响.方法:回顾性分析131例早期(发病后就诊时间＜4.5 h)急性脑梗死患者,其中PNS+rt-PA静脉溶栓治疗(PNS组)66例和rt-PA静脉溶栓治疗(对照组)65例.两组均常规治疗,PNS组中PNS注射液400 mg+5％葡萄糖注射液500 mL,1次/d,静脉滴注.观察两组治疗24 h和15d后的治疗效果,用试剂盒检测两组患者血液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、细胞纤维连接蛋白(human cellular fibronectin,c-Fn),CT检测两组HT情况,用美国国立卫生研究院卒中量表(NIH Stroke Scale,NIHSS)和Barthel指数评价其神经功能.结果:溶栓后24 h,与溶栓前相比,两组MDA,MMP-9,c-Fn及Barthel指数均显著升高,SOD及NIHSS评分均显著降低,PNS组的各项指标较对照组明显改善(t=2.54,2.50,2.52,2.55,2.55,2.57,均P＜0.05).治疗15d后,两组患者的各项指标(MDA,SOD,MMP-9,c-Fn,NIHSS评分及Barthel指数)较治疗前均显著改善(均P＜0.01),且PNS组较对照组显著改善(t=4.61,4.98,4.46,4.68,4.38,5.87,均P＜0.01);CT检测显示PNS组患者出血性转化率显著低于对照组(x2=4.15,P＜0.05).结论:PNS减轻急性脑梗死患者rt-PA静脉溶栓后缺血再灌注损伤可能与降低溶栓后出血转化率有关.     

组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的研制及其特性鉴定

目的：为应用ｔ ＰＡ单克隆抗体建立ＥＬＩＳＡ法检测ｔ ＰＡ含量以及研究ｔ ＰＡ功能和结构的关系。方法：运用杂交瘤技术成功地研制５株ｔ ＰＡ单克隆抗体，并进行较系统的免疫特性的鉴定。结果：５株单抗特异性高，与ｕ ＰＡ、ＰＬＧ、Ｆｇ、Ｆｂ、ＢＳＡ均无交叉反应；亲合力强１Ｈ４＞３Ｃ１０＞５Ｈ１０＞４Ｅ６＞４Ｃ６；腹水效价５×１０－６～１×１０－７；免疫球蛋白亚类为ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ；５株单抗中，３Ｃ１０和１Ｈ４可明显抑制ｔ ＰＡ活性，而５Ｈ１０、４Ｅ６、４Ｃ６则对ｔ ＰＡ活性无明显影响。结论：为进一步应用这些单抗作为研究手段提供了基础。     

人,牛内皮细胞组织型纤溶酶原激活物活性的比较

体外培养人脐静脉及胎牛主动脉内皮细胞,分别从其条件培养液中提取t-PA。实验主要分三步:1)胎牛内皮细胞t-PA的纯化;2)兔抗牛内皮细胞t-PA抗血清的制备及纯化其1gG组分;3)免疫亲和层析、纯化人脐静脉及胎牛主动脉内皮细胞t-PA。结果表明,用微量法免疫动物制备的兔抗牛内皮细胞t-PA抗血清具有较高的滴度与特异性。将该抗血清1gG与人、牛内皮细胞CM交联免疫亲和层析,可获得电泳纯的t-PA,其分子量为65000及67000道尔顿。两者活性比较,胎牛主动脉内皮细胞t-PA活性比人脐静脉内皮细胞t-PA明显增高。     

尿激酶型纤溶酶原激活物受体及可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体与炎症相关的研究进展

尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase plasminogen activator receptor,uPAR）与尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator,uPA）同为纤溶酶原激活系统的主要成员,是一种协调多种信号转导途径的多功能分子,可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（soluble urokinase plasminogen activator receptor,suPAR）是其可溶形式。除凝血-纤溶以外,uPAR参与了肿瘤侵袭及炎症等多种疾病过程,而suPAR可能是一种良好的炎性标志物。本文就uPAR及suPAR在炎症中的作用进行简要综述。     

人组织型纤溶酶原激活剂及其生理性抑制剂的结构与功能

一、人组织型纤溶酶原激活剂的结构和功能 人组织型纤溶酶原激活剂(Tissueplasminogen Activator,t-PA)由527个氨基酸组成,分子量约为67000,属丝氨酸类蛋白水解酶。它能使纤溶酶原(Plasminogen,Plg)变成纤溶酶(plasmin,plm),后者促使水不溶性纤维蛋白(Fibrin,Fb)水     

抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用

目的 研究抗组织型纤溶酶原激活物（tPA)单克隆抗体（mAb，鉴定其各种生物学活性。方法 采用传统的细胞融合，有限稀释法，制备稳定分泌mAb的细胞株，采用辛酸，硫酸铵沉淀法，纯化腹水中的mAb，以SDS－PAGE鉴定其纯度，运用ELISA和细胞免疫组化染色，鉴定mAb的各项特性。结果 获得了两株能稳定分泌抗tPAmAb的细胞株。用该两株细胞分泌的mAb能检测出0.4μg/L重组的tPA和血清中的tPA。结论 成功地研制了两株抗tPA的mAb，为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

手术应激对猪冠脉血管组织型纤溶酶原激活物快速释放的诱导作用

组织型纤溶酶原激活物 (t- PA)是一种来源于血管内皮、启动内源性纤溶作用的关键酶 ;作为对血栓性动脉闭塞的反应 ,活性 t- PA急性的释放调解可在数分钟内出现。目的　该项研究旨在观察外科手术对猪冠脉血管床中t- PA释放动力学的影响。方法　选取麻醉猪 (n=16 ) ,分别于胸骨切开术前、术后 1、 3、 5和 10 min检测冠状动 -静脉血流中 t- PA浓度差和血浆流量 (后者用逆向性热稀释法测定 )。结果　术前 ,冠状动 -静脉中 t- PA净流量 (释放或摄取 )无显著性差别 ,而手术却诱导 t- PA净释放量的快速上升 ;总 t- PA净释放量为 132 .6 ng·…     

纤溶酶原激活剂抑制物2型的结构与功能

纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)具纤溶抑制活性,是尿激酶(uPA)特异的抑制物。u-PA在肿瘤浸润与转移过程中起了十分关键的作用,PAI-2亦因此成为当今研究的热点。本文对PAI-2的基因结构、表达调控、蛋白质结构、功能及其作用机制等进行了综述。     

稳定表达组织型纤溶酶原激活因子基因的人脐静脉内皮细胞株的建立

为建立稳定表达组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的人脐静脉内皮细胞株,为其在基因修饰的组织工程血管中的应用奠定基础。首先构建t-PA基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/t-PA,将该表达载体用阳离子脂质体介导,转染人脐静脉内皮细胞系细胞,经G418筛选,获得阳性细胞克隆,扩增后分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-blotting)检测t-PA转录和蛋白表达水平,用底物发色法检测t-PA的活性。逆转录聚合酶链反应检测出了t-PA的稳定转染细胞克隆,免疫印迹证实该克隆细胞有含Myc标签的t-PA蛋白表达,底物发色法检测发现其表达产物的活性增加。结果证明成功建立了稳定表达t-PA基因的人脐静脉内皮细胞株。     

血清中尿激酶型纤溶酶原激活物在女性乳腺癌诊断中的应用

近年来,在我国京津沪地区,乳腺癌发病率已居于妇女恶性肿瘤首位川.研究表明,癌细胞在浸润转移的过程中存在着细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)和基底膜成分被相关蛋白酶溶解的活动,纤溶酶原激活在ECM水解过程中起重要作用.     

LPS促进HUVECs表达纤溶酶原激活物抑制物1

目的：观察LPS对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的影响。 方法： 用生长良好的第2、3代HUVECs进行试验。用cell counting kit-8(CCK-8)测定LPS刺激后细胞活性变化；发色底物法测定LPS组和对照组培养液中tPA, PAI-1活性；RT-PCR检测细胞内tPA和PAI-1 mRNA水平。 结果： 与对照组相比，LPS(10 mg/L)对细胞活性没有明显差异。LPS诱导PAI-1活性在24-72 h显著升高(P<0.05),且显著上调PAI-1 mRNA，24 h达到峰值，以后渐降，72 h达到正常水平。而LPS组与对照组tPA活性与tPA mRNA无明显差异(P>0.05)。 结论： LPS(10 mg/L)可显著上调PAI-1 mRNA转录和分泌而不影响tPA mRNA，结果提示LPS可活化内皮细胞，诱发PAI-1 mRNA表达和蛋白分泌而抑制纤溶系统，这有利于微血栓的形成、血栓稳定,血液凝固和DIC发生。     

抗单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备

尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）是近年来研究较多的溶血栓药物之一。它存在两种形式：单链尿激酶（ｓｃｕＰＡ）或称尿激酶原及双链尿激酶（ｕＰＡ）或称尿激酶〔１〕。由于临床发现ｕＰＡ大剂量注射易出现大面积出血的倾向，所以，人们对特异性强于ｕＰＡ的ｓｃｕＰＡ进行了深入地研究。由于ｓｃｕＰＡ能选择性地在纤维蛋白表面激活纤溶酶原，进而选择性地溶解血栓，而受到人们的重视。目前，我们虽已构建了高表达水平的工程细胞株，但纯化工艺有待进一步完善。鉴于国内尚未报道过ｓｃｕＰＡ单克隆抗体（ｍＡｂ）的制备，我们用常规细…     

组织型纤溶酶原激活剂基因转染AGZY83-a细胞移植入小鼠体内的表达研究

目的 探讨人组织型纤溶酶原激活剂（tissue-plasminogen activator,t-PA)基因转染AGZY83－a细胞（AGZY83－a/tPA)在动物体内表达的稳定性，以及通过细胞移植方法进行t-PA基因治疗的可行性。方法 将转染t-PA cDNA的AGZY83－a细胞在G418的严格筛选下体外培养，收集细胞制成悬液，注射入小鼠体内不同部位，定期检测小鼠血浆中t-PA的含量。结果 移植后，小鼠血浆中t-PA的含量与移植前及对照组比较差异有显著性（P＜0．01），并且至少可持续105天。其中腹腔注射组表达水平最高，皮下注射组次之，两者均明显高于股四头肌注射组。结论 转t-PA基因AGZY83－a细胞移植于小鼠体内可稳定表达t-PA，并且通过腹腔和皮下植入效果好于骨骼肌植入，为临床通过细胞移植进行t-PA基因治疗提供了初步的实验依据。     

外源性组织型纤溶酶原激活物信号肽突变体增强蛋白质在哺乳细胞中的表达及分泌

目的 比较不同tPA信号肽突变体对目的蛋白表达和分泌水平的影响,优化并筛选通用性外源信号肽序列.方法 通过定点突变技术将人类组织型纤溶酶原激活物（tPA）的信号肽第22位氨基酸由脯氨酸（P）突变为丙氨酸（tPA22P/A）或甘氨酸（tPA22P/G）,并将突变前后的3种信号肽序列分别插入HIV-1 p24基因的N末端,构建不同的p24蛋白表达载体,这些重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,转染72 h后,通过SDS-PAGE与western blot检测并比较各组培养上清和细胞中p24蛋白的表达水平.结果 成功构建了3个p24蛋白的真核表达载体P24T.tPA、P24T.tPA22P/A和P24T.tPA22P/G,经序列测定证实基因序列和方向与预期相符;重组载体转染293T细胞72 h后均检测到分泌性p24的表达.与P24T.tPA组相比,P24T.tPA22P/A转染组培养上清中和细胞内p24蛋白表达水平分别提高62%和29%,P24T.tPA22P/G转染组分别提高8%和6%.结论 tPA信号肽22位由脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸,这就提高了目的蛋白的表达和分泌水平,为优化外源蛋白在哺乳细胞中的表达和分泌提供了实验基础.     

人脐静脉内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂1对醒脑静干预的反应

背景：前期研究发现醒脑静能有效抑制兔心肌缺血再灌注模型的炎症递质及促纤溶作用,但是影响纤溶系统活性的作用机制未完全明确。目的：观察醒脑静对重组人肿瘤坏死因子α介导人脐静脉内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂1及其基因表达的影响。方法：取3-5 代人脐静脉内皮细胞,在培养基中添加10 μg/L 重组人肿瘤坏死因子α介导人脐静脉内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂1及其基因表达,醒脑静组加入不同浓度(5,10,20 mL/L)的醒脑静干预,阳性对照组添加氟伐他汀(1 μmol/L),并设立单纯人脐静脉内皮细胞培养的空白对照组。培育24 h后采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞上清液组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂1水平;采用反转录聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞的组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂1的mRNA表达。结果与结论：重组人肿瘤坏死因子α组纤溶酶原激活物抑制剂1分泌和mRNA表达较空白对照组显著升高 (P < 0.05),组织型纤溶酶原激活物分泌和mRNA表达较空白对照组显著降低(P < 0.05)。不同浓度醒脑静组纤溶酶原激活物抑制剂1分泌和mRNA表达均较重组人肿瘤坏死因子α组显著降低(P < 0.05),而组织型纤溶酶原激活物分泌和mRNA表达均较重组人肿瘤坏死因子α组显著升高(P < 0.05),且呈剂量依赖关系。结果证实,醒脑静作用可逆转重组人肿瘤坏死因子α所致的人脐静脉内皮细胞的纤溶活性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

胃癌组织中尿激酶型纤溶酶原激活剂及其受体基因表达和临床意义

目的：研究尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）及其特异受体（ｕＰＡＲ）与胃癌的关系及其在胃癌浸润转移中的作用。方法：采用ｃＤＮＡ－ｍＲＡＮ原位分子杂交技术,分别检测了６４例胃癌及其癌旁组织中ｕＰＡ和ｕＰＡＲｍＲＮＡ表达情况,同时结合病人的临床生物学指征进行分析。结果：癌与癌周比较,ｕＰＡ和ｕＰＡＲｍＲＮＡ阳性表达率明显升高,Ｐ〈０．００１。在伴有淋巴结转移的病例中,ｕＰＡ和ｕＰＡＲ阳性例数分别为１９／２９和２４／２９,与无转移的１０／３５和１３／３５相比,Ｐ分别〈０．０１和〈０．００１。在浸润到肌层、浆膜层的病例中ｕＰＡ和ｕＰＡＲ阳性例数分别为２５／３８和３０／３８,与浸润到粘膜和粘膜下层的４／２６例和７／２６相比,Ｐ均〈０．００１。在ｕＰＡ和ｕＰＡＲ同时阳性的病例中,伴有淋巴结转移和浸润到肌层以下的分别占１５／２     

基因重组纤溶酶原 Kringle 5 对血管生成抑制作用的研究

目的 研究基因重组纤溶酶原 (Kringle 5, K5) 对小鼠的血管生成的抑制作用。 方法 以体外 培养的小鼠内皮细胞为研究对象, 利用划痕实验和黏附能力测定实验观察重组 K5 对内皮细胞迁移、 黏附 能力的影响; 利用体外血管生成体系、 创伤愈合和鸡胚尿囊膜 ( chicken embryo allantoic membrane, CAM) 血管生成能力实验, 检测 K5 对血管生成作用的影响。 结果 200 nmol / L K5 显著抑制内皮细胞的迁移、 黏 附以及新生血管的生长长度。 并且 K5 在 2 ~ 18 mg / kg 浓度范围内对小鼠创伤愈合具有明显的抑制作用。 此 外, 6、 12 与 25 mg / L K5 显著抑制 CAM 血管生成, 25 mg / L K5 的抑制作用最强。 结论 K5 能明显抑制血 管生成, 为临床抑制血管生成治疗提供理论依据。