抗人DR5单抗致白血病U937细胞凋亡的作用机制

目的探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对白血病细胞U937凋亡诱导作用及机制。方法 MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测mDRA-6对U937细胞的生长抑制及凋亡诱导作用,Western blotting检测caspase8、10、3、9及Cytochome C在U937细胞凋亡过程中的表达及激活情况;选用caspase8、10、3抑制剂预处理U937细胞,观察是否抑制mDRA-6对U937细胞的凋亡诱导作用。结果MTT结果显示:10mg/L的mDRA-6作用U937细胞24h,细胞死亡率为61.09%,呈时间、浓度依赖性;流式细胞仪检测显示mDRA-6作用4h,细胞凋亡率为69.03%;Western blotting结果显示caspase10、3、9及Cytochome C均有活性片断表达,而caspase8无明显激活;caspase10和caspase3抑制剂部分抑制mDRA-6的凋亡诱导作用,caspase8抑制剂作用不明显。结论抗人DR5单克隆抗体mDRA-6通过死亡受体和线粒体途径诱导白血病U937细胞凋亡。     

抗人DR5单克隆抗体诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路

目的:探讨抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的线粒体信号通路。方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞生长增殖的影响,以及caspase-9、3抑制剂对mDRA-6抑制Jur-kat和U937细胞生长增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat和U937细胞DNA片段化降解;Western blot检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞bax、bcl-2、bcl-xl、Cyt c及caspase-9、3的激活改变。结果:mDRA-6呈时间、浓度依赖性地抑制Jurkat和U937细胞的生长增殖,10 mg/L的mDRA-6作用6、8和10小时,Jurkat细胞增殖抑制率分别达59.38%、72.56%和76.28%,U937细胞增殖抑制率分别达38.67%、47.54%和50.59%。琼脂糖凝胶电泳显示,10 mg/L的mDRA-6作用6小时,Jurkat和U937细胞均呈现凋亡细胞特有的DNA梯形条带;Western blot检测结果发现,随着mDRA-6作用时间延长,Jurkat和U937细胞内促凋亡分子bax增多,抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl减少,Cyt c释放明显增多,同时caspase-9、caspase-3也显示明显的激活表现。预先使用caspase-9抑制剂孵育细胞1小时,mDRA-6所致Jurkat和U937细胞生长抑制率分别降低了24.36%(t=5.44,P﹤0.01)和20.82%(t=4.29,P﹤0.01),mDRA-6所致Jurkat和U937细胞凋亡率分别降低了32.89%和23.97%。结论:线粒体信号通路激活是抗人死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡的途径之一。     

抗DR5抗体对食管鳞癌的细胞毒作用及机制

目的：探讨抗人DR5功能性单克隆抗体mDRA-6对食管鳞癌EC9706和109细胞的细胞毒作用及其作用机制。方法：利用MTT法检测mAb mDRA-6对食管癌细胞的细胞毒作用;在显微镜下观察食管癌细胞死亡的形态变化;以琼脂糖凝胶电泳检测食管癌细胞中的DNA片段化。利用流式细胞术检测食管癌细胞表面DR5表达、细胞凋亡率和线粒体膜电位;利用caspase抑制剂分析mAb mDRA-6的细胞毒作用机制。结果：mAb mDRA-6对食管鳞癌细胞有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性,但对食管上皮细胞NEC细胞没有毒性。经mAb mDRA-6处理,食管鳞癌细胞出现典型的细胞凋亡特征：细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体以及DNA片段化等。流式细胞术检测结果显示,食管癌细胞表面表达DR5,而食管上皮细胞NEC细胞不表达;经1.2μg/ml的mAb mDRA-6作用24小时后,大多数食管鳞癌EC9706和109细胞的表面均表达磷脂酰丝氨酸。Caspase 8的抑制剂几乎完全抑制mAb mDRA-6诱导的细胞凋亡,Caspase 9抑制剂的则影响小。此外,在mAb mDRA-6诱导的食管癌细胞凋亡的早期,线粒体膜电位不改变,在凋亡的晚期,线粒体膜电位降低。结论：mAb mDRA-6主要通过死亡受体信号传导途径诱导细胞凋亡,对食管鳞癌细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡中的作用

目的:探讨JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞Jurkat和U937凋亡过程中的作用.方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用;以Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和JNK抑制剂SP600125进行干预,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析Jurkat和U937细胞凋亡;利用免疫印迹技术检测mDRA-6作用下凋亡细胞的JNK蛋白的表达情况.结果:mDRA-6对Jurkat和U937细胞具有明显的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,10 μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞3小时,其凋亡率分别为62.62%和35.65%,JNK抑制剂干预后细胞凋亡明显增加;免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用细胞5分钟后JNK即呈现活性片段表达,并随作用时间的延长其活性增强,而Caspase全抑制剂干预后,5、15分钟JNK磷酸化增强,但随后随时间递减.结论:mDRA-6抑制Jurkat和U937细胞生长并诱导其凋亡,其凋亡过程中有JNK的激活并发挥抗凋亡作用.     

抗人DR5单克隆抗体mDRA-6对HL-60细胞的诱导凋亡作用

目的 观察抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体nDRA-6对HL-60细胞的凋亡作用.方法 制备抗人DR5单克隆抗体mDRA-6;荧光显微镜下观察mDRA-6作用后HL-60细胞的形态变化;MTT法测定不同浓度mDRA-6在不同作用时间对HL-60细胞存活的影响;通过FITC-Annexin V及PI标记细胞,以流式细胞仪检测mDRA-6对HL-60细胞凋亡率的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果 mDRA-6导致HL-60细胞染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成;mDRA-6对HL-60细胞具有明显的杀伤作用,24ng/mL mDRA-6作用HL-60细胞10 h,细胞死亡率达21.2%;1μg/mL的mDRA-6作用8 h,可使HL-60细胞死亡44.1%;Annexin V及PI双染显示,10μg/mL mDRA-6作用2 h,HL-60细胞的凋亡率达48.1%;20μg/mLmDRA-6作用HL-60细胞3 h,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显的"梯形"条带.结论 抗DR5单克隆抗体mDRA-6具有诱导HL-60细胞凋亡作用.     

抗人DR5单克隆抗体——mDRA-6与顺铂协同杀伤白血病细胞HL-60作用研究

目的：观察抗死亡受体5（Death receptor 5,DR5）单克隆抗体--mDRA-6与顺铂（DDP）对HL-60细胞的协同杀伤作用.方法：DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗DR5单抗--mDRA-6;流式细胞术测定顺铂对HL-60细胞表面DR5表达及细胞凋亡率;荧光显微镜下观察mDRA-6与顺铂协同作用下HL-60细胞形态变化;MTT法测定不同浓度的顺铂与mDRA-6对HL-60细胞存活的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6与顺铂联合对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果：顺铂可诱导HL-60细胞表面DR5表达增加,mDRA-6与顺铂联用致HL-60细胞出现染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成等细胞凋亡形态学变化;250 ng/ml的mDRA-6作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为16.61%;0.16 μg/ml的DDP作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为2.35%;二者联合作用后,HL-60细胞凋亡率增至57.10%;mDRA-6与DDP联合作用HL-60细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显“梯形”条带.结论：抗DR5单抗--mDRA-6与DDP对HL-60细胞具有强大的协同杀伤作用.     

槲皮素对U937细胞系抑制增殖和诱导凋亡作用的研究

目的 探讨黄酮类化合物槲皮素（Que）对人类单核细胞白血病U937细胞系的抑制增殖和诱导凋亡的作用。方法 应用MTT法检测不同浓度槲皮素对U937细胞的增殖抑制作用；AO／PI荧光染色后倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA的片段化；应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布。结果槲皮素能明显抑制U937细胞增殖，并存在剂量-效应关系和时间-效应关系；诱导U937细胞出现凋亡所具有的形态学和生化特征；随着槲皮素浓度升高，凋亡细胞和坏死细胞比例增加；将细胞特异性地阻滞在S期，出现凋亡峰。结论 槲皮素能抑制U937细胞增殖，诱导细胞凋亡，并具有细胞周期特异性。     

抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制。方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等凋亡相关蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势。免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等表达活性增加,并且Cytoc在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象。结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡。本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础。     

诱导细胞凋亡的抗hDR5单抗的研究

目的 研制能诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5单克隆抗体（McAb）。方法 以可溶性人死亡受体（death receptor，DR）5胞外段免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人DR5的McAb；MTT方法筛选分泌有细胞毒活性McAb的杂交瘤细胞；亲和层析方法纯化McAb；夹心ELISA法测定McAb亚型；Western blot和斑点ELISA法检测McAb的抗原表位类型；间接ELISA法检测McAb的特异性；流式细胞仪检测FITC-annexinⅤ／PI双色标记的Jurkat细胞的凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳测定凋亡细胞的DNA片段化。结果 获得1株杂交瘤细胞，其分泌的McAb命名为mDRA-6，为IgG1；其抗原表位类型为构象表位；其特异性识别hDR5，与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用；经McAb mDRA-6处理后，Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂，并导致Jurkat细胞中的DNA片段化。结论 mDRA-6是一个具有诱导细胞凋亡活性的新的抗人DR5功能性抗体，在以TRAIL／DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)诱导Jurkat细胞凋亡活性研究

目的：观察抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的死亡受体5（DR5）单克隆抗体——mDRA-6对Jut-kat细胞的凋亡作用。方法：DR5蛋白免疫BALB／c小鼠，融合筛选抗DR5杂交瘤细胞，制备抗人DR5单抗——mDRA-6；光镜下观察mDRA-6作用下Jurkat细胞形态变化；MTT方法计算mDRA-6不同浓度、不同作用时间对Jurkat细胞凋亡率影响。结果：mDRA-6致Jurkat细胞染色质边集、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成；MTT法显示mDRA-6具有明显的Jurkat细胞杀伤作用，0.1μg／ml的mDRA-6即可使Jurkat细胞存活率降至77．2％；25．6μg／ml的mDRA-6作用8小时，可使Jurkat细胞存活率降至28．4％；Annexin v及PI双染显示1μg／ml的mDRA-6作用10小时，Jurkat细胞凋亡率达81．82％。结论：抗DR5单抗——mDRA-6具有高效诱导Jurkat细胞凋亡的活性。