人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

重组小鼠凝血因子Ⅶ毕赤酵母表达载体的构建及整合体的筛选

目的构建无凝血活性的重组小鼠凝血因子Ⅶ(rmFⅦ)毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得rmFⅦ蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法PCR扩增得到mFⅦ基因片段,插入酵母表达载体pPIC9K的α分泌信号开放阅读框的下游,再经定点突变(K341A)得到pPIC9KrmFⅦ,测序正确的质粒用SacⅠ线性化后电穿孔转化毕赤酵母GS115,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合。结果获得了rmFⅦ毕赤酵母表达载体pPIC9KrmFⅦ,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。结论成功构建了rmFⅦ毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化rmFⅦ蛋白及后续研究奠定了基础。     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI

目的：在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达天然N-端rBPTI。方法：将PHOⅠ/bpti基因克隆到真核表达载体pPICZα,电转化毕赤酵母菌株X-33。 结果：构建了含PHOⅠ/bpti基因的表达质粒,并在 X-33中分泌表达rBPTI。用胰蛋白酶抑制实验筛选出表达rBPTI的工程菌。表达上清经阳离子交换层析分离纯化为单一组份,SDS-PAGE显示相对分子质量为 6 500。结论：PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中成功地诱导分泌表达了具有正确N-端氨基酸序列的rBPTI。     

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.     

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5'-非转录区(5'-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响.方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5'-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化.结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72 h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍.结论:pPIC9 5'-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达.     

EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的 构建pPICZα A-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础.方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定.结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白.结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZα A-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础.     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达

目的 根据毕赤酵母密码子偏好，设计并改造人CTLA4胞外区cDNA，构建毕赤酵母分泌型表达载体，以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法 利用PCR定点突变技术，将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列；经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9Ka分泌信号下游，SacⅠ线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌；PCR鉴定目的基因整合；甲醇诱导表达，SDS-PAGE、Westem blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果 成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变，该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的:提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性.方法:通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3.将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点,构建成凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3,将该质粒分别以限制性内切酶BamHI和XhohI进行酶切鉴定,将初步鉴定显示可能克隆有目的基因的质粒进行测序鉴定.结果:测序结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Noteborn报告的凋亡素基因序列一致,同源性为l 00%.在其起始密码子前添加了Ko zak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE.结论:采用两次PCR法可提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端,并构建成凋亡素真核表达载体.     

转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

[目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体，为研究其功能及其作用机制奠定基础。[方法]根据Bmi-1基因已知序列，设计合成一对引物，上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点，用反转录PCR（RT-PCR）方法从人红白血病细胞株（K562）总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段（1017 bp），插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-Bmi-1载体，经限制性核酸内切酶谱证实后，再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中，构建pLNCX2-Bmi-1真核表达载体，并经测序证实。然后以pLNCX2-Bmi-1为模板，物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段，并反向连接于表达载体（pLNCX2）上。[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确，RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段，正义DNA片断长度为1029bp，反义片断长度为171bp，Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。[结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增，并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达载体，为进一步研究该基因打下了基础。     

pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0 酵母表达载体     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定

目的　构建人肝细胞生长因子 (hHGF)的原核表达载体。方法　利用基因重组技术 ,将人肝细胞生长因子cDNA全长序列 ,定向克隆于表达型载体PUC18质粒的多克隆位点中 ,限制性内切酶酶切鉴定。结果　重组PUC18-HGF原核表达载体经限制性内切酶电泳分析 ,与理论值相符。结论　本实验成功将人肝细胞生长因子cDNA全长序列插入表达型载体PUC18多克隆位点BamHI和Xbal限制性内切酶位点之间 ,为通过基因工程获得外源性HGF提供实验依据     

适用于shRNA表达研究的克隆载体构建

目的:建立一种适用于shRNA表达研究的克隆载体。方法:通过PCR扩增一段含有自杀基因ccdB和卡那霉素抗性基因的DNA序列,将其双酶切后克隆至shRNA表达载体pSilencer3.1-H1neo中,得到重组体pSilencer3.1-ccdB。运用此重组体构建荧光素酶的shRNA表达载体并设立对照进行非重组背景的结果比较。结果:成功建立了pSilencer3.1-ccdB克隆载体。应用此载体构建荧光素酶的shRNA的表达载体,结果显示完全消除了非重组背景。结论:建立了适用于shRNA表达研究的克隆载体,为进一步研究siRNA的基因功能奠定了基础。     

pPICZα-synBPIm600酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPI_m23重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达,拟构建synBPI_m600酵母表达载体。以pUC18synBPI₄₁₄质粒为模板扩增synBPI₂₀₀基因片段,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI_185bp基因片段;EcoRI/SalI双酶切PBV220BPI_m600质粒获得BPI_m420基因片段;将上述2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E.coliTOP10F′,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定,结果与预期相符。提示:成功构建了pPICZαsynBPI_m600酵母表达载体.     

人骨形态发生蛋白-2的基因重组及其在大肠杆菌中的表达

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白２（ｈＢＭＰ２）。方法将包含ｈＢＭＰ２部分前肽和成熟肽的３′端７３０ｂｐｃＤＮＡ片段,插入原核表达载体ｐｋｐＬ３ａ的多克隆位点,构建成ｐＫｐＬ３ａ／ｈＢＭＰ２重组表达载体,转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,挑选阳性克隆,经诱导表达后用ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定。结果该克隆表达的ｈＢＭＰ２为ＭＷ２７０００,表达量占菌体总蛋白１０％,部分纯化后植入大鼠股部肌肉,组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生及骨与软骨形成。结论说明重组ｈＢＭＰ２具有诱导异位骨与软骨形成的生物学功能。