人IL-8正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建人IL- 8正义和反义真核表达载体.方法:RT-PCR扩增正义和反义IL- 8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+), 通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中, 并用RT-PCR和ELISA法检测细胞转染后IL- 8的表达水平.结果:经验证, 重组人IL- 8正义/反义真核表达载体构建正确.pcDNA3.1(+)-ssIL- 8转染A2780细胞后, 其IL- 8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)-asIL- 8转染SKOV3细胞后, 其IL- 8分泌水平降低.结论:成功构建了人IL- 8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ssIL- 8/pcDNA3.1(+)-asIL- 8, 为后续研究IL- 8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础.     

从卵巢癌cDNA表达文库筛选肿瘤抗原基因的研究

目的：利用肿瘤患者自体血清筛选患者肿瘤cDNA表达文库（SEREX）,寻找肿瘤特异性抗原是肿瘤免疫学研究的新策略,由此方法所获B细胞抗原肽可为进一步寻找T细胞抗原肽,开展肿瘤免疫治疗和诊断提供线索。方法采用SEREX方法,筛选中国人卵巢癌cDNA表达文库,对获得的阳性克隆片段测序鉴定和进行BLAST同源性比较。采用RT－PCR,分析政党组织和肿瘤组织及肿瘤细胞株中6个新的EST片段的表达。结果,所获基因片段大多数为已知抗原基因（20／27）。根据其来源又可归类为结构基因。线粒体基因和调控基因。另外,获6个未知的EST片段。RT－PCR的结果表明,4个EST（EST87888、1750、1754和3533）片 肿瘤和正常组织中均有表达,2个EST在正常组织中未见表达,而在肿瘤组织中有表达,可能是与肿瘤相关或特异的EST片段。结论SEREX方法不失为一种有效筛选卵巢癌肿瘤抗原的新方法。所获肿瘤抗原候选基因,可进一步进行结构和功能的研究。     

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的：用肝组织特异性启动子，实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1—6中的稳定表达。方法：从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA，用随机引物合成cDNA的第1条链，然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增，克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基因的正确序列，连接到肝特异性启动子的下游，使CD81基因的3′端与SV40polyA加尾序列融合，得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中，转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6。经G418加压筛选后，分别用RT—PCR检测人CD81 mRNA的转录，用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果：克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明，得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞，并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论：由于CD81是HCV的感染受体，稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得，为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物，以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。     

人间皮素基因中Wnt/β-catenin通路调控元件分析及在卵巢癌细胞中启动子区鉴定

目的分析人间皮素基因启动子区中Wnt/β-catenin信号通路相关转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)结合位点,鉴定间皮素基因在卵巢癌细胞表达相关核心启动子区。方法采用生物信息学方法分析人间皮素基因启动子区域内可能的TCF/LEF转录因子结合位点。克隆人间皮素基因5'端附近1 764 bp启动子序列,对该片段做5'端的不同截短,克隆至p GL3-basic报告基因载体,分别转染人卵巢癌细胞系SKOV3和3-AO,双荧光酶报告基因系统检测不同启动子片段活性。结果人间皮素基因启动子区含有多个潜在的TCF/LEF结合位点。成功克隆扩增间皮素基因启动子区-1456～+308、-164～+308、+47～+308三个片段,经测序证明无误,构建p GL3载体。转染SKOV-3与3-AO细胞后,双荧光酶报告基因系统检测显示-1456～+308与-164～+308片段在两个细胞系中均有较高启动活性,+47～+308片段活性较前两者显著下降(P均0. 01)。结论含有TCF/LEF转录因子结合位点的-164～+47序列是卵巢癌中间皮素基因表达的核心启动子区,为进一步观察卵巢癌中间皮素基因的表达调控机制奠定基础。     

应用噬菌体展示技术筛选人树突状细胞的特异结合分子

目的:从人肝癌T7 cDNA噬菌体展示肽库中筛选出能与人未成熟树突状细胞(iDC)特异结合的蛋白分子.方法:以人iDC为固相筛选目标,对人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库进行4轮生物淘选,ELISA鉴定噬菌体单克隆.阳性克隆经PCR扩增并测序后行同源性比对分析.结果:4轮筛选富集现象不显著,获得80个只与人iDC特异性结合的阳性克隆.测序显示部分克隆序列相同,生物信息学比对发现与人iDC特异结合的阳性噬菌体克隆的同源蛋白中,可能与肝癌发生相关的分子有:人铁蛋白轻链、甲胎蛋白、α1微球蛋白前体、G蛋白偶联受体116和跨膜蛋白49等.结论:从人肝癌17 cDNA噬菌体肽库中筛选获得了能与人iDC特异结合的分子,为阐明人肝癌发生发展过程中肿瘤免疫逃逸相关机制奠定了基础.     

RFDD-PCR方法建立卵巢癌组织差异表达谱

目的:采用限制片段差异显示聚合酶链反应(RFDD-PCR)建立卵巢癌组织与正常卵巢组织基因差异表达谱,分析卵巢癌相关基因的表达差异.方法:采集上皮性卵巢癌手术患者的卵巢癌组织和正常卵巢组织,用RFDD-PCR建立卵巢癌组织与正常卵巢组织基因差异表达谱,对各组织间有表达差异的基因进行生物信息学分析,筛选与卵巢癌发病机制相关的基因.结果:构建了两种不同组织的基因表达谱,获得有意义的电泳条带5642条,其中卵巢癌组织2227条,正常卵巢组织3384条,癌组织和正常组织间有表达差异的片段为2082个,占表达数的36.9%.结论:利用RFDD-PCR差异显示技术能够建立卵巢癌组织和正常卵巢组织基因差异表达谱.     

卵巢癌组织与正常卵巢组织差异表达谱的初步分析

目的:通过采用限制片段差异显示聚合酶链反应(RFDD-PCR)建立卵巢癌组织与正常卵巢组织基因差异表达谱,分析比较卵巢癌发病机制相关基因的表达差异。方法:采集上皮性卵巢癌手术患者的卵巢癌组织和正常卵巢组织,用RFDD-PCR技术平行检测,对各组织间有表达差异的基因进行生物信息学分析,筛选与卵巢癌发病机制相关的基因。结果:运用RFDD-PCR技术,构建了两种不同组织的基因表达谱,通过对卵巢癌组织及正常卵巢组织差异表达谱的分析中发现与肿瘤的发生、发展密切相关的原癌基因和抑癌基因、细胞周期相关基因、增殖和凋亡相关基因、血管生长因子、代谢酶等6类基因36种因子的表达差异。结论:利用RFDD-PCR差异显示技术能够建立卵巢癌组织和正常卵巢组织基因差异表达谱,是对肿瘤的发病机制和寻找治疗靶点研究的一种有效的手段。     

共刺激分子B7.1在淋巴瘤组织中的表达

目的研究免疫共刺激分子Ｂ７．１在淋巴瘤组织中的表达及其在肿瘤免疫逃逸机制中的作用。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ及原位杂交技术对１２例新鲜及２３例石蜡包埋淋巴瘤组织中Ｂ７．１的表达进行了检测。结果１０／１２例新鲜瘤组织及１６／２３例石蜡包埋瘤组织Ｂ７．１表达阳性，同时还意外发现，所有阳性标本中还强表达一种与正常Ｂ７．１分子不同但与其相关的ｍＲＮＡ转录子。结论该转录子与淋巴瘤的关系及在肿瘤免疫中的作用值得深入研究     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础