大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性

目的建立分离培养大鼠真皮来源多能干细胞（SKPs）的方法并探讨其生物学特性。方法0．25％中性蛋白酶（protease）选择性的消化表皮与真皮的细胞连接，剥离真皮，采用0．25％的胰蛋白酶消化真皮层细胞于超低黏附培养板中进行悬浮无血清培养，机械法传代，免疫荧光染色法检测细胞表面分子的表达，体外诱导其向脂肪细胞分化，研究其多分化潜能。结果体外培养2～3d后真皮多能干细胞聚集成球悬浮生长，培养4代后去除生长因子后并添加血清培养，细胞帖壁生长，呈长梭形成纤维样，免疫荧光染色显示，体外培养的真皮多能干细胞可表达CD29和Nestin，不表达CD34与vimentin。体外诱导实验结果显示体外培养的真皮多能干细胞能够被诱导成脂肪细胞，油红染色阳性。结论采用悬浮培养方法可成功分离培养大鼠真皮多能干细胞，培养的细胞可表达神经干细胞标志并具有多分化潜能。     

真皮来源成体多能干细胞的分离鉴定和生物学性状的研究

目的:从新生大鼠和成人真皮组织分离鉴定多能干细胞,并研究其生物学性状。方法:以新生大鼠背部皮肤和成人包皮为研究对象,依据体外贴壁生长的性状,采用酶消化法分离真皮多能干细胞,通过定向诱导其多向分化实验进行鉴定。结果:早期贴壁筛选的新生大鼠和成人皮肤组织原代真皮细胞克隆经过传代培养后细胞形态均一,约90%的细胞处于 Go/G1期,细胞表面波形蛋白表达阳性,但Ⅷ因子和角蛋白表达阴性。经诱导分化后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有多能分化潜能。体外培养的多能干细胞具有异质性,含有体积大小不同的细胞亚群。绿色荧光蛋白 GFP 基因转染真皮多能干细胞可获得良好表达。结论:大鼠和人真皮组织中均存在成体多能干细胞,提示真皮可能是成体多能干细胞的又一来源。     

成年大鼠神经干细胞的体外培养和鉴定

1992年Reynolds和Weiss发现,在胚胎及成年中枢神经系统(central nervous system,CNS)室管膜下区,存在一群具有多向分化潜能和自我更新及克隆性扩增的细胞.近年来的研究发现,神经再生是成年哺乳动物大脑中普遍存在的现象,由成年神经干细胞进行的神经再生,对于生理状态下的多种神经活动和病理状态下大脑功能的修复有着重要意义.笔者从成年大鼠大脑海马中分离培养了具有干细胞特征的细胞,对成年神经干细胞进行了初步的研究.     

不同年龄人真皮多能干细胞的分离及体外分化特点

目的研究不同年龄人真皮多能干细胞的分离、鉴定及体外分化特点。方法切取胎儿、患儿、中青年患者、老年患者正常皮肤标本（1cm×1cm），采用干细胞培养基筛选原代细胞克隆并记录其数量和直径；检测各种标本来源细胞克隆的体外分化情况；行单个细胞克隆分化分析，并检测其相关蛋白的表达。结果胎儿、患儿、中青年患者、老年患者正常皮肤原代培养获得的细胞克隆数分别为（20．1±2．5）×10^2、（15．8±5．7）×10^2、（10．8±1．3）×10^2、（6．2±1．4）×10^2个，两两比较，差异有统计学意义（P＜0．01）；克隆直径分别为（83±12）、（55±10）、（46±12）、（42±8）μm，胎儿＞患儿＞中青年及老年患者（P＜0．05）。各种细胞克隆均能向神经元细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞分化，其中胎儿来源的细胞克隆有向神经元细胞分化的优势。培养1个月，胎儿、患儿、中青年患者、老年患者单个细胞克隆形成率依次为41．1％、25．5％、17．7％、15．2％；单个细胞克隆亦能同上多向分化，同时表达巢蛋白、纤维连接蛋白、原癌基因c-mye、信号转导和转录激活因子3、端粒体逆转录酶。结论采用干细胞培养基能够有效分离不同年龄人真皮中具有克隆增殖和多向分化潜能的干细胞，年龄对其的数量、增殖和分化有明显影响。     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

表皮干细胞和真皮干细胞的概念定位及其标记物的研究进展

成体干细胞(adult stem cell)是一类存在于所有能自我更新的组织中的原始细胞,具有终身、无限的自我更新能力,能够产生至少一种以上高度分化的子代细胞,并在细胞的生长和分化过程中起着主导作用.     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及电镜观察

我们在成功分离培养鼠神经干细胞的基础上[1,2 ] ,对神经干细胞的生长发育特性进行电镜观察。一、材料与方法1.材料 :一级昆明E12 13孕小鼠(本校动物中心提供 ) ,改良的Eagle培养液 (DMEM /F12 ) ,胎牛血清 ,表皮生长因子 (EGF) ,均购于Gibco公司 ;N 2添加剂 (N2 supplement)、Nestin抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)抗体、神经丝蛋白 2 0 0 (NF 2 0 0 )抗体 ,购自Sigma公司 ;免疫组织化学检测系统购自博士德公司。透射电子显微镜 (日立 F75型 )。2 .细胞的分离培养及传代 :无菌条件下剖腹取胎鼠 ,在解剖显微镜下分离胎鼠大脑半…     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究

[目的]探讨在成骨诱导条件下兔脂肪干细胞的体外诱导分化情况：[方法]取3个月龄日本大耳白兔颈背部皮下脂肪，用Ⅰ型胶原酶消化获得细胞。Stro-1免疫细胞化学染色鉴定细胞性质；加入成骨诱导液后依次进行形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。[结果]（1）原代所获细胞Stro—1表达阳性？（2）在诱导条件下，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。[结论]脂肪干细胞来源广、易获取、对机体创伤小，与骨髓间充质干细胞类似，经体外诱导后可实现成骨分化，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞：     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

兔阴茎海绵体内皮细胞的体外培养与鉴定

越来越多的研究证实阴茎海绵体内皮细胞功能低下与ED关系密切。体外分离、培养内皮细胞是研究血管内皮功能的重要手段，但有研究表明不同种属、不同器官来源的血管内皮细胞在结构、功能、抗原成分、代谢特性及对生长因子的反应等方面均有显著差异。因此，阴茎海绵体内皮细胞（corpus cavernosal endothelial cells，CCECs）的体外分离、     

人表皮干细胞的体外分离与培养

目的 探索人表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的分离方法和培养体系。方法 用Ⅳ型胶原纯化、富集ESCs，将黏附细胞（实验组）和未黏附细胞（对照组）分别接种在Ⅳ型胶原摹质（实验组为A1，对照组为A2）和3T3细胞滋养层（实验照组为B1，对照组为B2），培养体系为：低糖无钙DMEM培养基（添加10％胎牛血清、表皮生长因子10μg／L、氯化钙0．05mmol／L、氢化可的松0．8mg／L），观察细胞能否呈克隆状生长，用流式细胞仪和免疫细胞化学染色，对ECSs周期和表型进行分析。结果 实验组细胞呈克隆状生长，G0／G1期细胞和α6^briCD71 dim细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组角蛋白19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈刚性。结论 人ESCs可通过Ⅳ型胶原快速黏附分选，并可在适当的培养体系里扩增。     

人脂肪组织来源干细胞体外培养条件的优化

目的探索人脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件。方法人腹部皮下脂肪抽吸取材,采用胶原酶消化法获取细胞,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。比较了不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果。结果采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为1h时,2.0mg/ml组消化细胞总数最多,活细胞比值与其他组比较,差异有显著意义。在消化时间为2h时,消化细胞总数较1h各组均增加,同时,1.0、1.5和2.0mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0mg/ml组和1.5mg/ml组最高。采用0、5%、10%、15%、20%五种不同血清浓度培养后发现,15%和20%组生长特性最佳,明显优于另外三组。结论对于人脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0mg/ml、消化时间2h、血清浓度15%是最佳的培养条件。     

人脂肪组织来源干细胞体外培养条件的优化

目的探索人脂肪组织来源干细胞体外培养的最佳条件。方法人腹部皮下脂肪抽吸取材,采用胶原酶消化法获取细胞,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。比较了不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果。结果采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为1h时,2.0mg/ml组消化细胞总数最多,活细胞比值与其他组比较,差异有显著意义。在消化时间为2h时,消化细胞总数较1h各组均增加,同时,1.0、1.5和2.0mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0mg/ml组和1.5mg/ml组最高。采用0、5%、10%、15%、20%五种不同血清浓度培养后发现,15%和20%组生长特性最佳,明显优于另外三组。结论对于人脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0mg/ml、消化时间2h、血清浓度15%是最佳的培养条件。     

兔胚胎关节软骨细胞体外培养的研究

目的 探讨兔胚胎软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 对孕4周兔胚胎关节软骨用酶消化法分离培养细胞。观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学改变。结果 兔胚胎软骨细胞可从胚胎软骨组织中消化分离出来，经鉴定具有软骨细胞的特性。原代兔胚软骨细胞存活率达97％以上，细胞贴壁率达80％以上，从原代到第4代都有高增殖力，到第8代时增殖力降低。到第12代时几乎丧失细胞增殖。结论 体外培养的胚胎软骨细胞前4代适合于作修复关节软骨缺损的组织工程细胞。     

兔阴茎海绵体内皮细胞的体外培养与鉴定

越来越多的研究证实阴茎海绵体内皮细胞功能低下与ED关系密切.体外分离、培养内皮细胞是研究血管内皮功能的重要手段,但有研究表明不同种属、不同器官来源的血管内皮细胞在结构、功能、抗原成分、代谢特性及对生长因子的反应等方面均有显著差异[1].     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 体外观察大鼠骨髓间充质干细胞的基本生物学特性,建立rMSCs的分离培养方法,为诱导分化成肌研究打下基础.方法 采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs.观察细胞的形态和生长特性,倍增时间,生长曲线,用流式细胞仪分析rMSCs的表面抗原.结果 体外培养的rMSCs很快贴壁.4～8d即贴壁80%,细胞增殖迅速,7d左右即可达到80%融合.流式细胞仪分析CD90、CD13、CD44表达强阳性,CD14、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,符合MSCs的表面抗原特征.结论 经Percoll密度梯度离心法获得的rMSCs细胞株较纯,可作为组织工程中的种子细胞来源,但大鼠MSCs在体外培养过程中易于衰老.     

人骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究

目的观察体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和生长规律,以证实人MSCs是一种理想的种子细胞,以及为进一步深入研究提供基础理论依据。方法对人骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs。观察原代、传代细胞的结构、生长情况,对第2代MSCs表面抗原进行测定。结果MSCs原代培养第14～16d时细胞融合成单层,传代细胞保持原代细胞的形态特征。超微结构显示:第2代MSCs细胞核形态不规则,部分核可见多个核仁,胞质内细胞器形态分化幼稚。细胞的生长曲线显示:传代第3d起呈对数生长,第5d达到高峰,10代后无明显克隆出现。P1代克隆形成率为25.83%±2.93%,P5代为14.67%±1.63%,P10代为4.67%±0.52%。MSCs的表型特征显示细胞均一性较好,MSCs表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。结论用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选法,可分离、纯化人MSCs,方法简单、经济,易应用;MSCs增殖能力强,可在体外大量扩增,能满足组织工程的要求,是理想的种子细胞之一。