碱性烧伤后角膜修复的实验研究

本研究应用氚－胸腺嘧啶核苷（＾３Ｈ－ＴｄＲ）标记ＤＮＡ，对角膜碱性烧伤后再生修复过程的病理改变进行了实验性研究，动态地观察了新生毛细胞管的内皮细胞，角膜细胞，胶原纤维的变化，探讨了这些成分在角膜烧伤后发生修复中的作用，为角膜化学伤的治疗提供理论参考。     

兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中作用的实验研究

利用显微手术切除＋０．２５Ｎ氢氧化钠溶液碱烧伤的方法制备动物实验模型。观察兔眼角膜缘干细胞在角膜上皮损伤愈合中的作用。结果显示：全周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，角膜上皮愈合时间长（２５．８天）。愈合后含有大量新生血管和杯状细胞，呈现结膜上皮表型。半周角膜缘上皮切除合并角膜上皮缺损组，上皮愈合时间缩短（６．３天），含有少量新生血管和杯状细胞。保留角膜缘上皮单纯角膜上皮缺损组，上皮愈合时间最短（３天），无新生血管及杯状细胞，呈角膜上皮表型。结果表明：角膜缘上皮干细胞在角膜上皮损伤愈合中起着极重要的作用，是损伤后角膜上皮再生的源泉。     

穿透性角膜移植术后角膜内皮细胞之命运

地２组猴行５。５→５．０ｍｍ穿透性角膜移植术，异种组４只，同种组４只，术前用冷冻创伤＾３Ｈ－ＴｄＲ标记法标记受生角膜内皮细胞，术后１４周摘除眼球，用放射自显影法显示银颗粒的分布。     

角膜干细胞与角膜表层新生血管

从干细胞角度探讨角膜碱烧伤后表层新生血管的成因。对大鼠角膜缘部进行碱性烧灼造成不同程度的损害，连续观察5周，结果，缘部基底细胞完全破坏者，角膜以新生血管化愈合，而保留缘部基底细胞者，角膜无新生血管化。本实验进一步证实了角膜干细胞缘部基底层定位的观点，提示干细胞对碱性烧伤后阻止角膜的新生血管化，并重建角膜表面的完整性具有重要意义。     

准分子激光角膜原位磨镶术后1年角膜内皮细胞变化 …

目的：研究人类准分子激光角膜原位磨镶术矫正高度近视后角膜内皮细胞的变化。方法对３１例接受准分子激光角膜原位磨镶术矫正了－８．２５－１８．５０Ｄ视的患者，术前和术后用角膜内皮显微镜系列地了角膜中央区内皮细胞。其中２１例，为接触镜配载者为１０例为未曾配过接触镜者，分析中央部内皮细胞的密度，细胞大小的变异系数和六边形状，对所有组将术后３，６和１２月获取的数据与术前进行比较。     

消炎痛对电光性眼炎防治作用的病理学研究

本文用环加氧酶抑制剂－０．５％消炎痛油剂分别在紫外线照射前、后１５分钟滴眼，３小时后进行兔角膜组织病理学检查。对照组光镜下可见角膜上皮细胞肿胀、核碎裂、基底细胞胞浆嗜酸性染色增强；透射电镜下角膜基底层上可见坏死脱落的上皮细胞，基底细胞胞浆空泡增多，线粒体肿胀，内质网扩张。而用药组光镜下和透射电镜下见细胞结构基本正常。实验结果提示，０．５％消炎痛油剂在电光性眼炎防治方面有应用价值。     

热休克蛋白A12B在大鼠角膜、晶状体和视网膜组织中的表达

目的　观察大鼠角膜、晶状体、视网膜中热休克蛋白Ａ１２Ｂ（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎＡ１２Ｂ,ＨＳＰＡ１２Ｂ）的表达。方法　取ＳＰＦ级ＳＤ大鼠９只,用水合氯醛处死后立即摘取眼球,采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＲＴ-ＰＣＲ分别检测大鼠角膜、晶状体和视网膜组织中ＨＳＰＡ１２Ｂ蛋白和ｍＲＮＡ的表达情况;免疫荧光化学法观察ＨＳＰＡ１２Ｂ在角膜、晶状体和视网膜组织中的表达及定位。结果　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＲＴ-ＰＣＲ检测结果显示:ＨＳＰＡ１２Ｂ在大鼠角膜、晶状体、视网膜均有少量表达,其中角膜组织（０．２８０±０.０３４、０．３７４±０.０３１）中表达强度相对最低,晶状体（０．３３１±０．０３６、０．４５３±０．０４０）次之,视网膜组织（０．４５３±０．０２９、０．６８０±０．０４５）中表达强度最高。免疫荧光化学法结果表明,在角膜组织中ＨＳＰＡ１２Ｂ主要表达于上皮层,其中基底细胞染色最强,而角膜基质细胞上仅有弱表达;在晶状体组织中ＨＳＰＡ１２Ｂ主要表达于上皮细胞和皮质;在视网膜组织中ＨＳＰＡ１２Ｂ主要表达于视网膜神经纤维层、神经节细胞层和内核层,并与ＮｅｕＮ标记的神经元及ＧＳ标记的Ｍüｌｌｅｒ细胞存在共定位。结论　ＨＳＰＡ１２Ｂ在大鼠角膜、晶状体、视网膜组织中均有表达,且呈特异性表达。     

全植床深板层角膜移植术后角膜上皮基底细胞的共焦显微镜活体动态观察

目的通过对全植床深板层角膜移植术（FBDLK）后不同时期角膜上皮基底细胞的观察，了解角膜基底上皮在经冰冻保存过的角膜材料表面上的重建过程。方法20例（20眼）行FBDLK的患者在术后的不同时期分别进行裂隙式角膜共焦显微镜检查。对所得的清晰的角膜基底细胞的图像进行“反色”法电脑自动分析，获得基底细胞密度、细胞面积和细胞多形性变异率等数据并作统计学分析。结果FBDLK术后3～4d，植片表面上皮化已基本完成，此时植片中央区的基底层细胞密度较低，细胞体积较大呈近圆形；至术后15d时，角膜基底细胞的密度、面积和细胞多形性变异率等与正常对照组无明显差异；观察至术后12个月上述指标均保持稳定。结论-20℃冰冻保存角膜材料作为供体行FBDLK术后，植片表面能较快地完成上皮化，上皮基底细胞在术后15d时密度和形态已经恢复正常。     

应用~3H－TdR掺入法标记活体角膜内皮细胞的初步报告

用液氮冷冻兔和猴角膜，造成角膜内皮创伤。在ＤＮＡ合成期前房注入氚标记的胸腺嘧啶核苷（３Ｈ—ＴｄＲ），使之掺入角膜内皮细胞核内。这种标有３Ｈ—ＴｄＲ的内皮细胞将在体内长期存活。再用放射自显影法显示出标记细胞。用此法可获得带有稳定标记的角膜内皮细胞的动物模型，用来观察穿透性角膜移植术后角膜内皮的动态变化。     

角膜碱烧伤后大鼠角膜新生血管的细胞学研究

背景微血管壁由周细胞和血管内皮细胞组成，以往人们对血管系统的研究主要集中于血管内皮细胞，而对血管周细胞的研究较少。目的观察角膜碱烧伤后新生血管形成过程中的血管内皮细胞和周细胞的变化，探讨周细胞对新生血管生长的影响。方法36只健康成年SPF级sD大鼠，浸有1mol／LNaOH的4mm自制涂药器放置于右眼角膜中央3s，制作碱烧伤动物模型，3只正常sD大鼠作为正常对照。分别于角膜烧伤后1、2、3、5、7、10d各处死6只大鼠获取平行于角膜缘的环形切片，采用双重免疫荧光染色法检测CD31和α—SMA在角膜组织的表达，以分别评估血管内皮细胞和周细胞的分布，观察角膜碱烧伤后二者在角膜组织中的动态变化。光学显微镜下分别计数抗Ot—SMA阳性的周细胞数和抗CD31阳性的内皮细胞数，以二者的比值作为周细胞包裹指数（PCI），定量分析角膜碱烧伤后新生血管对周细胞的募集情况。结果角膜碱烧伤后1dCD31即可在角膜浅基质层表达，呈红色荧光，随着角膜碱烧伤时间的延长，CD31在角膜组织中的表达逐渐增加并进入深基质层，至角膜碱烧伤后7d表达的细胞数减少。呈绿色荧光的α一SMA在角膜碱烧伤2d于角膜浅基质层表达，在实验观察期内表达量均少于CD31，至碱烧伤后7d，残留的CD31阳性细胞被α—SMA阳性细胞包裹，未被包裹的CD31阳性细胞多数发生消退。碱烧伤后1、2、3、5、7、10d的PCI分别为0、16．07％、11．95％、43．84％、73．97％、86．21％，呈现递增的趋势。结论大鼠角膜碱烧伤后周细胞对血管内皮细胞的包绕可能对新生血管的成熟与稳定发挥重要作用。     

兔角膜缘上皮细胞端粒酶表达的实验研究

目的探讨将角膜上皮各区域表层和基底层细胞端粒酶作为角膜缘干细胞标志物的可能性。方法采用端粒重复序列扩增(TRAP)方法分别对8只新西兰大白兔(8只眼)角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定性分析,并利用生物发光技术对角膜缘和中央透明角膜上皮细胞端粒酶活性进行定量分析。其中4只兔(4只眼)结膜下注射5氟尿嘧啶(5-Fu)20mg,4只兔(4只眼)未注射任何药物。结果8只兔眼透明角膜上皮细胞平均生物发光值为34912,端粒酶表达均为阴性;角膜缘上皮细胞平均生物发光值为165575,端粒酶表达均为阳性,二者比较差异有统计学意义(P=0．001)。5-Fu注射组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为185396,未注射5-Fu组角膜缘上皮细胞平均生物发光值为145754,二者比较差异有统计学意义(P=0．02)。阳性对照组生物发光值为210832,阴性对照组生物发光值为34793。结论角膜缘上皮细胞端粒酶表达阳性而透明角膜上皮细胞表达阴性,表明角膜缘存在具有极强增殖能力的干细胞,端粒酶可能成为角膜干细胞的标志物。     

角膜缘干细胞移植治疗角膜表层失代偿病变

目的 探讨角膜缘干细胞移植对角膜表层失代偿病变的治疗效果。方法 显微镜下分离清除角膜病变组织。取健康角膜缘含干细胞组织,移植于相当原角膜缘部,有睑粘连、睑球粘连、结膜囊畸形者,同时行粘连分离及结膜囊成形术。结果 以1年以上随访资料完整者16例18眼,获得了较好的角膜上皮再生复盖,睑球粘连解除或明显减轻,溃疡无一穿孔,胬肉无一复发。结论 角膜干细胞移植,能有效地恢复角膜上皮功能,可用于角膜热灼伤、酸硷烧伤、睑球粘连及大的或复发性胬肉等各种角膜表层失代偿病变的治疗。     

Isolation of putative corneal epithelial stem cells from cultured limbal tissue

PURPOSE: To investigate methods of isolating putative corneal epithelial stem cells from cultured limbal tissue. METHODS: Three extraction techniques were compared to identify an efficient method of obtaining a large number of viable corneal epithelial stem cells from the limbus. Limbal tissues were extracted by incubation at 37 degrees C or 4 degrees C for 1 or 16 hours, respectively, with 1.2 U/ml dispase/trypsin or by treatment with 0.05% trypsin and 0.01% ethyldiaminetetraacetic acid (EDTA) at 37 degrees C in single procedure. Collected cells were cultured on NIH/3T3-seeded plates, and colony forming efficiency (CFE) was evaluated. Fluorescence activated cell sorting (FACS) was performed with a Coulter EPICS 753 after incubation with Hoechst 33342 and propidium iodide (PI). Hoechst negative cells were obtained using gates exhibiting low Hoechst blue with a 424/44 nm BP filter. Gated cells of each fraction were re-cultured to assess the capability of colony formation. RESULTS: The mean numbers of viable cells obtained from treatment with dispase and trypsin was 3 x 10(4) cell/ml and 8.06 x 10(5) cell/ml at 37 degrees C and 4 degrees C incubations; the number increased to 1.21 x 10(6) cell/ml with a trypsin/EDTA treatment (p < 0.05). CFE was 9.67 +/- 2.13% and 6.63 +/- 2.35% in rabbit and human cells, respectively. Likewise, the Hoechst negative fraction was 3.61 +/- 0.42% and 5.21 +/- 4.91% in rabbit and human cells, respectively. The sorted Hoechst negative cells were cultured through four passages, forming small round colonies. In rabbit cells, the CFEs of Hoechst negative and positive fractions after FACS, were 12.67 +/- 2.24% and 1.17 +/- 6.13%, respectively (p < 0.05). CONCLUSIONS: Putative corneal epithelial stem cells were efficiently isolated from limbal tissue using a trypsin/EDTA extraction and FACS. This technique may be very useful in tissue engineered stem cell therapy.     

羊膜移植及丝裂霉素对碱烧伤大鼠角膜缘基质微环境的影响

目的观察羊膜移植及丝裂霉素C（MMC）对碱烧伤大鼠角膜缘基质微环境的影响。方法采用SD大鼠角膜缘碱烧伤模型。将大鼠随机分为5个组：A组为正常组,B组为羊膜移植组,C组为羊膜移植联合MMC组,D组、E组为未干预组（D组为碱烧伤1周组,E组为碱烧伤2周组）。通过苏木精-伊红染色观察病理学改变,免疫组织化学技术观察髓过氧化物酶（MPO）、肝细胞生长因子（HGF）免疫染色阳性细胞数的变化。结果干预组（B组、C组）较未干预组（D组、E组）角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少,组织病理学染色证实角膜缘及其周边上皮细胞为多层结构,角膜新生血管减少及基质中炎性细胞浸润减轻。免疫组织化学结果显示MPO及HGF含量明显减少,B组、C组之间MPO含量差别不明显,C组中的HGF含量明显减少,上皮细胞层数轻微减少。结论羊膜移植和羊膜移植联合MMC可以改善角膜缘碱烧伤大鼠模型中的角膜缘基质微环境,MMC可能通过抑制成纤维细胞分泌HGF而影响上皮细胞的增生和移行。     

深低温保存的角膜缘组织CD40的表达以及体外培养增生活性的研究

目的探讨深低温保存的角膜缘组织CD40的表达情况以及培养后增生活性的变化。方法取角膜移植术后角膜缘组织20例（20眼）,其中10例新鲜组织直接进行体外培养,另10例经深低温冷冻保存后再进行体外培养,对比观察两组细胞生长情况,并用免疫组化方法检测CD40在二者的表达。结果新鲜角膜缘组织块接种后3d可见细胞贴壁生长,培养至6d时细胞基本形成单层;深低温保存角膜缘组织块接种后在7d可见细胞贴壁生长,培养至10d时细胞基本形成单层。CD40在两组角膜缘上皮基底细胞层均有着色,为棕褐色,在深低温保存角膜缘组织表达明显减弱。结论深低温保存的角膜缘组织具有良好的增生活性,利用深低温保存的角膜缘组织进行角膜缘干细胞移植可以降低移植排斥率。     

Effects of salicylate and steroid on neutrophil migration and corneal blood vessel growth

Cauterization of the cornea results in emigration of neutrophils from the limbal blood vessels into the corneal tissue. Blood vessel proliferation follows, the stimulus for which is unknown. In this study, 0.1 M sodium salicylate drops administered topically to cauterized rat corneas over a 48-h period had an inhibitory effect on the migration of neutrophils from the limbal vessels 6 h after injury, but this was not maintained at 48 h. After 6 days of treatment, the salicylate had no effect on vessel growth into the cauterized rat cornea. Application of prednisolone disodium phosphate ointment to cauterized corneas also inhibited neutrophil migration at 6 h, but increased the extravascular neutrophils at 48 h. After 6 days of treatment, corneal blood vessel growth was significantly reduced. It was concluded that there is no consistent relation between the number of extravascular neutrophils at the corneal limbus and the extent of corneal blood vessel growth.     

自体角膜缘上皮移植治疗翼状胬肉

目的观察自体角膜缘上皮移植术治疗翼状胬肉的疗效。方法采用自体角膜缘上皮移植术对６８例（７６只眼）初发和复发性翼状胬肉患者进行治疗,术后随访６～１８个月。结果６８例（７６只眼）中,５６例（６２只眼）上皮愈合稳定,角膜恢复正常光滑、透明,无异常翼状胬肉样组织生长。１２例（１４只眼）失访。结论自体角膜缘上皮移植可为病变区角膜及结膜提供新的干细胞来源,是治疗初发性和复发性翼状胬肉的理想方法。     

组织工程角膜上皮治疗兔角膜缘干细胞缺乏症的研究

目的 评价以纤维凝胶膜为载体,体外培养自体角膜缘干细胞移植术治疗角膜缘干细胞缺乏症的临床效果。方法 制作兔眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,取对侧眼角膜缘组织进行干细胞培养,并以纤维凝胶膜为载体制成组织工程角膜上皮。将实验动物随机分为4组,其中Ⅰ-Ⅲ组为实验组,行组织工程角膜上皮移植术,Ⅰ组移植术后观察3个月,Ⅱ组移植术后观察1个月,Ⅲ组移植术后观察2周。Ⅳ组为对照组,移植不含干细胞的凝胶膜,术后观察3个月。以角膜上皮染色、角膜混浊及新生血管3项指标进行临床疗效评定,通过病理检查评估术后不同时期角膜上皮修复情况,印迹细胞学检查移植前后角膜上皮的细胞表型,免疫组织化学染色观察角膜上皮特异性角蛋白K3、MUCSAC及转录因子p63在移植角膜上皮的表达。结果 实验组角膜上皮逐渐愈合,透明度提高,新生血管减退或消失;对照组角膜呈持续混浊,上皮缺损迁延不愈,最终大量新生血管长入,上皮结膜化。临床指标评分比较,差异有统计学意义（P=0．021）。角膜上皮印迹细胞学检查显示对照组为PAS（＋）的结膜细胞表型,而实验组上皮细胞PAS（-）。组织病理学显示实验组为正常角膜上皮结构,对照组为结膜化生的上皮,可见血管和杯状细胞。免疫组织化学显示实验组角膜上皮表达角膜上皮特异性角蛋白l（3（AE5）,不表达结膜特异性MUCSAC,在上皮基底部表达转录因子p63。对照组上皮持续表达MUCSAC。结论 组织工程角膜上皮移植术是一种有效的治疗角膜缘干细胞缺乏症的方法,可重建眼表,修复角膜上皮的损伤,抑制角膜上皮结膜化和新生血管。纤维凝胶膜为一种新型的组织工程材料,吸收快,透明度高,具有良好的组织相容性,是一种较理想的移植载体材料。（中华眼科杂志．2006．42：679-685）     

Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease

PURPOSE: To bioengineer a corneal surface replacement using ex vivo expanded, cultured corneal epithelial stem cells seeded on a matrix derived from amniotic membrane and use this bioengineered graft to manage difficult ocular surface disease. METHODS: Fourteen patients with ocular surface disease unresponsive to standard medical and surgical treatments, including seven patients with presumed limbal stem cell deficiency were chosen for transplantation of a bioengineered composite corneal surface in eye each. Presumed corneal stem cells were harvested from either the patient's or related donor's limbus, expanded ex vivo, and cultivated on a carrier of modified human amniotic membrane. The resulting composite cultured tissue was transplanted to the ocular surface of the diseased eye, from which the abnormal tissue had been surgically removed. Ten patients received autologous grafts, and four received allogeneic grafts. RESULTS: A successful outcome, defined as restoration or improvement of vision, along with maintenance of corneal re-epithelialization and absence or recurrence of surface disease was obtained in 6 of the 10 patients with autologous procedures and in all 4 allogeneic transplants. Follow-up ranged 6-19 months with a mean of 13 months. CONCLUSIONS: This novel technique documents that presumed corneal epithelial stem cells can be harvested safely from the limbus, expanded successfully in vitro, and grown on denuded amniotic membrane. The resultant composite cultured tissue can be transplanted and appears to successfully manage eyes with difficult ocular surface disease, including those with stem cell deficiency. This technique minimizes the threat of damage or depletion to the contralateral or donor limbus.     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。