不同荧光定量PCR技术在HBV检测中的应用评价

【摘要】 目的：评价国产普通荧光定量PCR技术与罗氏内标法荧光定量PCR技术在HBV检测中的意义。 方法：采集安徽医科大学第一附属医院2014年3月-12月HBV患者的血清190份,分别用上述方法进行检测,通过相关性分析和Kappa检验评价两种试剂检测结果之间的差异性及一致性。结果：①190份标本中,罗氏Cobas 试剂与国产试剂检测结果呈线性相关(R2=0.6707,P<0.05）;②分成HBeAg( )与HBeAg(-)两组比较,两组中Cobas 试剂与国产试剂检测均呈线性相关(R2=0.5864,P<0.05;R2 =0.5226,P<0.05）;③根据不同HBeAg状态和抗病毒要求的DNA载量对标本进行一致性分析,HBeAg( )组Kappa值为0.752;HBeAg(-)组Kappa值为0.381。结论：对于HBeAg( )患者,可以应用国产试剂检测患者的HBV-DNA水平,而对于HBeAg(-)患者,建议应用Cobas 试剂检测其患者的HBV-DNA水平。 关键词 肝炎,乙型,慢性;肝炎病毒,乙型; 聚合酶链反应 乙型肝炎病毒标志物     

荧光定量PCR技术在人巨细胞病毒检测中的应用

目的:探讨人巨细胞病毒(HCM V)在哺乳期妇女乳汁及婴儿尿液样本中的感染状况,并明确其母婴传播的情况。方法:应用荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测533例样本(乳汁227例,尿液306例)的HCM V-DNA,其中186例为母子配对样本。结果:533例样本中,HCM V-DNA阳性284例,阴性249例,总体阳性率为53.3%。140例母乳HCM V-DNA阳性产妇喂养的婴儿中,其尿液阳性率(62.6%)明显高于母乳阴性喂养的婴儿(30.4%)。结论:母乳感染是婴儿HCM V获得性感染的主要途径之一。采用FQ-PCR法进行HCM V-DNA的检测,可作为HCM V感染诊断标准化的发展方向之一。     

荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染者免疫学检测与HBV-DNA的关系,为合理治疗乙肝患者提供准确的依据。方法采用荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒进行研究。结果在HBV-DNA阳性的血清标本中,HBcAb阳性率为94.0%;在HBV-DNA阴性但HBsAg阳性标本中,HBcAb阳性率为94.7%。结论定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎的诊断及治疗均有一定的临床意义。     

实时荧光定量PCR技术的研究进展

聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用。近年来出现的核酸定量PCR技术尤其是实时荧光定量PCR（RQ—PCR）技术口。实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术的研究进展及其在核酸定量检测中的应用做一综述。     

乙肝五项指标与荧光定量PCR HBV DNA检测相关性分析

本文采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）测定了1006例血清中HBV DNA,并与酶联免疫吸附测定（ELISA）的结果做了比较。现报告如下：     

荧光定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸与乙型肝炎血清标志物的关系研究

目的　了解乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒 (HBV)复制及传染性。方法　运用酶联免疫吸附测定 (EL ISA)法检测 HBV血清标志物和荧光定量聚合酶链反应 (FQ- PCR)检测 HBV DNA,并对其结果进行分析比较。结果　乙型肝炎大三阳患者血清 HBV DNA检出率为 10 0 % ,平均拷贝数为 2 .0 9× 10 7/m L,HBV DN A的对数值为 7.3± 1.6 ;小三阳患者血清 HBV DN A检出率为 6 4 .5 % ,平均拷贝数为 6 .76× 10 4 /m L,HBV DNA的对数值为 4 .8± 1.2。结论　同时进行乙型肝炎血清标志物的 EL ISA检测及 HBV DNA的 FQ- PCR检测 ,有利于临床对 HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定。     

荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA及临床意义评价

目的:新设计荧光定量聚合酶链反应方法可定量检测血清中乙型肝炎病毒(HBV),以指导临床对乙型肝炎诊疗。方法:采用AG9900 Robo Master PCR仪及相配套Amplisensor定量试剂,全封闭、全自动地定量检测了669例临床血清标本中HBV DNA。结果:224例HBeAg阳性者,其HBV DNA对数均值为8.64±0.88拷贝数/毫升、阳性率为99.12％,明显高于HBeAg阴性者6.95±1.13拷贝数/毫升、阳性率50.85％(p<0.05);401例HBsAg阳性者血清中HBV DNA7.94±1.21拷贝数/毫升、明显高于HBsAg阴性者5.74±0.70拷贝数/毫升(p<0.05)。结论:能对HBV DNA准确定量,真实地反映HBV感染状况及复制水平,有助于临床对乙型肝炎及时诊断,抗病毒药物选择、疗效考核及预后判断等均有较高应用价值。并能克服普通PCR易污染、易导致假阳性等缺点。     

HBV-DNA定量在慢性乙型肝炎抗病毒治疗中的临床意义

目的通过检测HBV-DNA定量,对慢性乙型肝炎患者抗病毒的疗效观察。方法125例慢性乙型肝炎患者,其中HBV-DNA定量1．0×10~5～9．9×10~6copies/ml 75例为A组,＞1．0×10~7copies/ml 50例为B组。两组均用干扰素抗病毒治疗,疗程半年。结果A组治疗效果优于B组,治疗前HBV-DNA高水平复制者,HBeAg转换率低于HBV-DNA低水平复制。结论抗病毒的疗效与HBV-DNA在体内复制水平相关；动态检测HBV-DNA定量有利于诊断病情、监测、评价抗病毒的疗效,以及指导用药具有重要意义。     

应用PCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒变异rtI233V

目的 建立一种应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测乙型肝炎病毒(HBV)变异rtI233V的方法 .方法 参照GenBank收录的HBV基因逆转录(RT)区序列设计PCR引物,根据HBV RT区rt233位野生型和变异犁的序列,分别选择Bst1107I和Bsp1407I两种内切酶.以rtI233V变异株及野毒株质粒为模板进行PCR扩增,PCR产物分别用Bst1107I和Bsp14071两种限制性内切酶进行酶切,观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带变化.并以变异型和野生型质粒的不同配比,分析该检测方法 的敏感性.结果 本研究建立的PCR-RFLP方法 可同时检测野毒株和rtI233V变异株.PCR扩增后,野毒株和rtI233V变异株的PCR产物长度均为255 bp.以Bst 11071酶切,野毒株质粒的PCR产物可以切成75 bp和180 bp两段,rtI233V变异株PCR产物的长度保持不变.以Bsp1 4071酶切,rtI233V变异株质粒的PCR产物可以切成75bp和180bp两段,野毒株质粒的PCR产物长度保持不变,测序结果 与上述结果 一致.敏感性检测表明,此方法 至少可检出标本中10%的变异株.应用此方法 检测100例慢性乙型肝炎患者,筛选出2例rtI233V变异患者.结论应用PCR-RFLP方法 可检测rtI233V变异,具有较高的敏感性,可用于HBV变异rtI233V的早期诊断.     

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂临床研究要点

目的阐述乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的临床研究要点。方法结合体外诊断试剂现行法规和此类试剂自身的特点,对其管理分类、研究方法、临床试验方案设计、临床试验样本选择、结果的统计学分析以及临床试验报告撰写等方面进行了详细解析。结果与结论乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的临床研究应从试剂本身的临床预期用途出发,重点针对试剂定量准确性、特异性进行科学的临床考察。     

定量聚合酶链反应检测乙型肝炎患者血清HBV—DNA及其临床应用

目的：探讨乙型肝炎患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量与乙肝标志物和肝损害程度的关系,方法：采用信号引物能量转移定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）,检测１９３例各型乙肝患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量。结果：在慢性乙肝患者中,随着临床肝损害程度加重,血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量逐渐下降,血清ＨＢｅＡｇ阳性组ＨＢＶ－ＤＮＡ含量明显高于抗－ＨＢｅ及抗－ＨＢｃ阳性组,而后两组中部分病例ＨＢＶ－ＤＮＡ水平仍很高,血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量     

多重聚合酶链反应病原菌检测快速诊断感染性眼内炎的价值

目的探讨多重聚合酶链反应(MPCR)快速诊断感染性眼内炎的临床应用价值。方法感染性眼内炎患者38例(42眼),依据感染性眼内炎常见细菌、真菌共有引物片段建立的MPCR方法检测,结果与常规细菌和真菌培养方法相比较。结果 42份样本中,MPCR检出细菌阳性28份、真菌阳性8份、混合感染2份,检出率90.5%(38/42);常规培养方法检出26份细菌性阳性、真菌性9份、混合感染2份,检出率88.1%(37/42);两种方法的阳性菌检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MPCR与常规方法均有较高的特异性和灵敏度;但MPCR检测花费时间短,有利于感染性眼内炎的快速诊断。     

HBV-M与HBV-DNA结果差异研究

目的探讨乙肝患者HBsAg（＋）血清中乙肝病毒血清学标志物（HBV-M）模式与HBV-DNA检测结果的相互关系,了解HBV-M模式其对应的HBV-DNA载量。方法用TRFIA法定量测定HBV-M,取乙肝表面抗原阳性标本同时用荧光聚合酶链反应（FQ-PCR）对患者进行HBV-DNA检测。结果在271例患者血清中检测出HBV-DNA病毒基因拷贝值范围为2．1×10^3～3．8×10^7copies／ml,平均含量为3．0×10^4copies／ml,总阳性检出率为48．0％（130／271）。模式4HBV-DNA阳性率高于其他模式差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HBV-M和或HBV-DNA检测评价乙肝疗效或治愈标准都存在一定的局限性,需要联合诊断和寻找新的指标。     

聚合酶链反应检测结核杆菌DNA的临床研究

目的 研究荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测临床标本中结核分枝杆菌核酸DNA的应用价值.方法 应用荧光定量PCR技术对80例活动性肺结核患者痰、40例结核性胸膜炎患者的胸水进行结核杆菌DNA检测,同时涂片镜检与培养,并对3种方法检测的阳性率进行比较.结果 80例活动性肺结核患者痰、40例结核性胸膜炎患者的胸水荧光定量PCR阳性率分别为56.2％、27.5％;涂片镜检阳性率分别为16.2％、0.0％;结核培养法阳性率分别为37.5％、2.5％.结论 荧光定量PCR技术较传统方法具有较高的敏感性与特异性,尤其对涂片染色与结核培养阴性的结核病具有更大的诊断价值.     

低浓度血清HBV-DNA模板两种提取方法的比较

目的:评价、分析两种不同核酸提取方法对血清HBV-DNA定量测定的影响。方法:本文选取了煮沸裂解法和柱纯化法分别对低浓度和高浓度HBV-DNA阳性血清处理,通过荧光定量PCR法进行定量测定,比较两种方法的定量结果并计算相对提取效率。结果:经统计学t检验,柱纯化法处理低浓度血清的HBV-DNA定量值高于煮沸裂解法,但对高浓度血清,两种方法差异不显著。煮沸裂解法的相对核酸提取效率分别只有柱纯化法的23%与19%。结论:煮沸裂解法处理血清标本具有操作简单,经济快速的优点,但不能适用于处理低浓度血清标本。而柱纯化法提取核酸模板效率较高,处理低浓度标本时能提高检测灵敏度。     

荧光PCR技术检测HBV—DNA的初步研究

目的：研究荧光PCR技术在临床的应用价值。方法：选择90份HBV－ELISA阳性标志物血清进行HBV－DNA的检测,从血清中提取DNA,运用iCycler-PCR软件进行荧光PCR扩增,对结果进行分析。结果：HBsAg-HBeAg-HBcAb组阳性率为96．7％,HBsAg-HBeAb-HBcAb组阳性率80％,HBeAg-HBcAb组阳性率55％。结论：荧光PCR技术是一种良好的检测HBV－DNA的技术,但尚不能作为乙型肝炎治愈与否的诊断标准。     

荧光定量PCR法在检测246例小儿巨细胞病毒感染中的应用

目的：探讨FQ-PCR在诊断小儿巨细胞病毒感染的临床应用价值。方法：分别应用血清抗体检测和荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）的方法对患者进行血液和尿液病毒的检测,并对确诊的患者进行母乳CMV病毒的检测。结果：在怀疑为活动性CMV感染的169例患儿中,PCR法的阳性检出率为75.1%,血清IgM法为52.1%,两种方法的阳性符合率为86.4%;18例尿液CMV-DNA阳性的患者查出母亲乳汁中CMV-DNA,含量为1.7×10～4.5×103copies/mL。结论：FQ-PCR可以准确检测患儿体液及血液中的CMV含量,提示体内复制情况,对于临床的诊断和治疗有一定的指导意义。     

突变特异PCR检测YMDD突变方法的建立及应用

目的 建立检测YMDD突变的方法并了解乙型肝炎后肝硬化患者采用拉米夫定治疗后YMDD突变的状况.方法 采用突变特异PCR技术研究YMDD突变.结果 采用突变特异PCR技术和PCR-RFLP方法同时对30份HBV DNA阳性血清标本进行检测,2种方法的YMDD突变检出率基本相符.120例肝硬化患者治疗前无1例检测到YMDD突变,拉米夫定治疗组患者治疗6、12和24个月YMDD突变率分别为0(0/60)、8.5%(5/59)和17.9% (10/56),而对照组患者没有1例发生YMDD突变.结论 突变特异PCR技术检测YMDD突变简便特异.YMDD突变的发生率随着拉米夫定用药时间的延长而增高.     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.