RNA干扰抑制KLF10基因对MG-63细胞成骨分化的影响

目的:研究Kruppel样因子10(KLF10)在MG-63细胞向成骨细胞分化过程中的作用。方法:采用RNA干扰的方法抑制MG-63细胞中KLF10的表达,并使用成骨分化培养液诱导细胞分化,实时定量PCR检测成骨分化标志性基因ALP、OC、BSP及转录因子Runx2的mRNA的表达量变化,蛋白质印迹检测Runx2的蛋白表达。结果:诱导分化后,KLF10表达抑制细胞的ALP、OC的mRNA表达量低于正常细胞(P<0.05);KLF10表达抑制会直接导致Runx2的mRNA及蛋白表达量降低。结论:KLF10在MG-63细胞成骨分化过程中发挥重要作用。     

重楼皂苷I对成骨细胞MC3T3-E1增殖及分化的实验研究

目的:研究重楼皂苷I (PPL I)对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖的作用及其机制。方法:采用MTT比色法、EdU试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)活性检测法、茜素红染色法,观察加入PPL I (1、3、10、30μmol/L)后,MC3T3-E1的增殖、成熟与矿化情况;采用免疫印迹法,观察PPL I (3、10μmol/L)对细胞中β-连环素(β-catenin)和骨形成蛋白-2 (BMP-2)的表达影响。结果:PPL I可以有效地促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖,并浓度依赖性地升高β-catenin与BMP-2蛋白的水平。结论:PPL I能促进MC3T3-E1细胞的增殖与分化,可能与其调节β-catenin与BMP-2的表达有关。     

复合阿伦磷酸钠骨水泥对成骨细胞的影响

目的：研究不同阿伦磷酸钠含量的骨水泥对成骨细胞的影响，确定复合阿伦磷酸钠骨水泥的细胞毒性。方
法：根据阿伦磷酸钠含量不同分成6组，在50 g Cemex®XL骨水泥粉末中分别加入0，10，50，100，500，1 000 mg阿伦
磷酸钠，依次命名为G0~G5组。通过电镜观察各组成骨细胞样MG-63的黏附能力，MTT比色法测定吸光度值，碱性磷
酸酶试剂盒测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase activity，AKP)活性，Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒测定凋亡率，相差
显微镜观察骨矿化情况。结果：各组MG-63细胞黏附能力良好；与G0组相比，G1~G4组抑制细胞凋亡，G5组促进细
胞凋亡和抑制细胞增殖(P<0.05)；各组特异性碱性磷酸酶活性、骨矿化能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在50 g
骨水泥粉末中加入阿伦磷酸钠不超过500 mg对成骨细胞无毒性。     

三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2表达及碱性磷酸酶活性的影响

研究三七总皂甙(PNS)对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2(BMP-2)表达及碱性磷酸酶活性的影响,探讨其在骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化中的作用机制。方法分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),实验按不同质量浓度PNS分组(0、50、100、150、200mg.L-1),以0mg.L-1为对照组。均采用成骨诱导液培养,MTT法观察细胞增殖,ALP活性测定,Western Blotting检测细胞BMP-2表达。结果在第3、5天各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),在第7、9天,50、100、150mg.L-1组高于对照组(P<0.05);BMP-2表达水平及ALP活性在50、100及150mg.L-1组高于对照组(P<0.05),对照组少量表达BMP-2;200mg.L-1组细胞增殖、BMP-2表达水平及ALP活性与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论三七总皂甙可通过上调BMP-2的表达水平,增强碱性磷酸酶活性,促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化。     

缩宫素对人骨肉瘤细胞系MG-63增殖及成骨活性的影响

目的：研究缩宫素（OT）对人成骨细胞系MG-63增殖及成骨活性的影响，阐明其在骨代谢调节方面的作用。方法：用含OT 10、50和100 nmol/L的培养基孵育MG-63细胞1、3、5和7 d采用MTT法检测OT作用下细胞增殖活性的变化，选择其中最低有效浓度进一步检测OT作用下MG-63碱性磷酸酶（ALP）活性的变化。结果：MTT法检测显示，50和100 nmol/L OT作用1、3、5和7 d后MG-63细胞的增殖活性明显高于对照组（P<0.05）；10 nmol/L作用7 d后MG-63细胞增殖活性明显高于对照组（P<0.05）。ELISA检测显示，50 nmol/L　OT作用3、5和7 d后MG-63细胞ALP活性明显高于对照组（P<0.05）。结论：OT对MG-63细胞增殖有调节作用，能够正向促进成骨细胞的增殖和分化。     

腺病毒介导BMP-2和BMP-6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的作用研究

目的 研究骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的作用.方法 分别用重组腺病毒AdBMP-2、AdBMP-6和AdGFP感染骨肉瘤细胞MG63和U2OS,利用台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶(ALP)活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化.结果 与感染AdGFP的相应骨肉瘤细胞株(对照组)相比,分别感染AdBMP-2和AdBMP-6的两种骨肉瘤细胞株的细胞存活率随时间延长逐渐降低,凋亡率逐渐增加,细胞穿膜数逐渐减少,ALP活性逐渐增加.结论 BMP-2和BMP-6可以抑制人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的增殖和迁移,并诱导它们凋亡和向成骨细胞分化.     

人成骨肉瘤MG—63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间,用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶（ALP）活性;放射免疫法测定骨钙素（BGP）含量;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶（MMP）-1和基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）-1基因mRNA表达;Van GieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG-63细胞接种培养第7d后I型胶原基因表达较高。MMP-1表达量随时间推移逐渐增加,至第24d达到高峰。第1-9d TIMP-1表达量逐渐增加,其后基本恒定。ALP活性第0-12d逐渐增高,至第12d达最高,其后逐渐下降。第18d后,细胞有许多大小不等的结节形成,I型胶原结节染色较无结节处深。MG-63细胞具有成骨细胞表型特征。MG-63细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段,具I型胶原,MMP-1,TIMP-1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

胶体金对MC3T3-E1增殖、分化及RUNX2基因表达的影响

目的研究30nm胶体金对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。方法体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1,在仪-MEM培养液中加入不同体积的胶体金处理细胞,利用M1Tr法检测胶体金对成骨细胞增殖活性的影响,碱性磷酸酶活性测定及RT—PCR法分别检测其对成骨细胞分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。结果浓度为10^（-10）、10^（-11）、10^（-12）mg／L的胶体金均促进成骨细胞的增殖,且ALP相对活性及RUNX2基因表达也均高于阳性对照组。结论30nm胶体金能促进小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2的表达,进而促进成骨。     

骨形成蛋白-2结合纤维连接蛋白体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的观察

目的:研究骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨细胞分化的能力.方法:SD大鼠的MSCs分离培养后,分为4组:对照组;A组(加入100 μg/ml BMP-2);B组(加入 10 ng/ml FN);C组(加入100 μg/ml BMP-2和10 ng/ml FN),通过检测不同时间点(3,6,9,12天)各组细胞数量﹑细胞碱性磷酸酶(ALP)活性﹑成骨细胞表型以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析各组成骨诱导能力的差异.结果:A组、B组和C组细胞形态,成骨细胞表型检测都发生了变化;各组的细胞数和ALP活性随着培养时间的延长而增加,但C组变化最明显,与相同时间点其他各组相比,差异有统计学意义(P<0.05).电镜观察发现各组材料上均有细胞生长,但C组细胞的黏附生长状况明显好于其他组.结论:BMP-2和FN在体外能明显促进MSCs向成骨细胞分化,两者具有明显的协同效应,可以作为理想的成骨诱导剂应用于组织工程.     

VEGF对兔骨髓基质干细胞成骨诱导及成骨细胞分化与增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下成骨诱导剂和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的联合应用对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)成骨分化过程中细胞增殖和分化的影响,为骨组织工程研究提供实验基础。方法取2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后抽取股骨骨髓进行BMSCs原代细胞培养,取生长良好的第三代BMSCs进行分组培养。空白组:完全培养基培养;对照组:完全培养基中加入成骨诱导剂;实验组:完全培养基中加入成骨诱导剂及VEGF(10ng/ml)。MTT法检测诱导BMSCs成骨分化过程中细胞生长与增殖情况并绘制生长曲线;倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察诱导BMSCs成骨分化过程细胞的形态特征;茜素红(Alizarin Red S,ARS)染色鉴定钙结节;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、ALP活性及RT-PCR检测I型胶原(Collagen typeⅠ,colⅠ)mRNA表达;免疫组化染色检测诱导后细胞中VEGF蛋白表达情况。结果 1诱导BMSCs向成骨细胞分化后细胞呈圆形或多边型,短柱状或立方形,细胞表面有短的突起与相邻细胞连接。2茜素红染色光学显微镜下可见实验组和对照组均有散在的红色团块即钙结节。3二组中ALP染色均可见细胞浆内有黑色的碱性磷酸酶颗粒,但实验组ALP染色阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。4诱导培养的成骨细胞ALP活性测定实验组和对照组ALP活性早期较低,以后逐渐增高,第四天起,实验组明显高于对照组(P<0.05)。5MTT法检测细胞增殖状态,实验组细胞增殖速度高于对照组,6~8d细胞增殖速度加快,二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。6RT-PCR检测成骨细胞colⅠmRNA表达,诱导后实验组和对照组均可见colⅠmRNA表达,实验组colⅠmRNA的表达强度高于对照组。7免疫组化染色显示BMSCs的VEGF蛋白呈阴性表达,而诱导分化后的成骨细胞实验组与对照组均可见有VEGF蛋白表达且实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1BMSCs在成骨诱导剂作用下可向成骨细胞诱导,成为骨组织工程中理想的种子细胞。2 VEGF可促进成骨细胞的增殖和分化,当与成骨细胞诱导剂联合应用时,能够提高成骨细胞的增殖能力、增强成骨细胞的ALP活性,二者的协同作用共同促进了BMSCs向成骨细胞的增殖和分化,将有望提高骨缺损修复的治疗效果。     

人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG 6 3细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间 ,用α 磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;放射免疫法测定骨钙素 (BGP)含量 ;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶 (MMP) 1和基质金属蛋白酶抑制因子 (TIMP) 1基因mRNA表达 ;VanGieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG 6 3细胞接种培养第 7d后I型胶原基因表达较高。MMP 1表达量随时间推移逐渐增加 ,至第 2 4d达到高峰。第 1～ 9dTIMP 1表达量逐渐增加 ,其后基本恒定。ALP活性第 0～ 12d逐渐增高 ,至第 12d达最高 ,其后逐渐下降。第 18d后 ,细胞有许多大小不等的结节形成 ,I型胶原结节染色较无结节处深。MG 6 3细胞具有成骨细胞表型特征。MG 6 3细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段 ,且I型胶原 ,MMP 1,TIMP 1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

尼尔雌醇和左炔诺孕酮对人成骨肉瘤 MG-63细胞株雌激素受体亚型的作用

目的：观察不同浓度的尼尔雌醇(NYL)和左炔诺孕酮(LNG)对人成骨肉瘤MG-63细胞株ERα和ERβ表达的作用，探讨旁分泌效应对ERα和ERβ基因表达的影响。方法：人成骨肉瘤MG-63细胞株分为（1）空白对照组：用含1% BSA无血清MEM培养液培养48 h；（2）阳性对照组：培养液中加入10-8 mol/L的17β-estradiol (E2) 培养48 h；（3）药物处理组：培养液中分别加入10-10，10-8，10-6 mol/L的NYL或LNG培养48 h；（4）药物处理+换液组：培养液中分别加入10-10 mol/L的NYL或10-8 mol/L LNG培养48 h，每12 h更换新的含有相应药物的培养液。用半定量RT-PCR检测各组细胞ERα和ERβmRNA的表达。结果：NYL及LNG均能诱导ERα和ERβ亚型mRNA表达上调，诱导ERαmRNA表达的最强作用浓度均为10-6 mol/L。NYL，LNG对ERβ mRNA表达最强作用浓度分别为10-10，10-8 mol/L。每12 h更换干预培养液对ERα表达无影响，但可抑制ERβ的表达。结论：NYL和LNG均可诱导MG-63细胞株ERα和ERβ mRNA表达上调，且2种亚型的表达存在相互制约关系；在NYL和LNG诱导ER亚型表达上调过程中ERβ的表达可能受到旁分泌作用的影响。     

氟尿嘧啶联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞的抑制作用及其对TRPV5和TRPV6蛋白表达的影响

目的:研究氟尿嘧啶联合顺铂对骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用,探讨其对瞬时性受体电位通道5(TRPV5)和瞬时性受体电位通道6(TRPV6)蛋白表达的影响。 方法:常规培养MG-63细胞,以5×10⁴mL^-1的细胞密度种植细胞,实验分为对照组、氟尿嘧啶组、顺铂组及氟尿嘧啶联合顺铂组4组。CCK-8法检测不同时间MG-63细胞的生长抑制情况;分别于24、48和72 h采用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒检测MG-63细胞加入不同药物后的凋亡情况;免疫细胞化学染色法检测MG-63细胞在加药前后TRPV5和TRPV6蛋白的表达情况。结果:氟尿嘧啶和顺铂对MG-63细胞的抑制作用均显著,且随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞中黑色颗粒增多,胞体回缩,细胞老化或死亡。与两药单独或是联用作用于MG-63细胞24 h比较,随着时间的延长,48 h 和72 h两者对细胞的抑制作用明显增强(P<0.05)。与对照组比较,氟尿嘧啶组和顺铂组24、48和72h后凋亡率逐渐增加(P<0.01),随着药物作用时间的延长,细胞凋亡率亦呈升高的趋势。当加入氟尿嘧啶和顺铂72 h后,MG-63细胞表达TRPV5和TRPV6含量较加药前明显降低(P<0.05)。结论:氟尿嘧啶与顺铂联用可以提高MG-63细胞增殖抑制及凋亡作用,同时对MG-63细胞TRPV5和TRPV6表达水平具有明显的抑制作用。     

siRNA沉默细胞周期蛋白A2基因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的研究siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向cycllnA2基因的siRNA,用oligofectamine将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞（HSF）中,用无义siRNA转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照,实时-聚合酶链反应（PCR）、Western印迹方法检测cyclinA2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cycllnA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞PCNA及cyclinB1基因表达的改变。结果1、10、50、100nmol／L浓度的cyclinA2-siRNA分别使MG-63细胞cyclinA2基因表达降低了9．4％,56．4％,79．2％和84．3％,同时cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10nmol／L及50nmol／LsiRNA后48h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39．1％及54．9％,细胞周期阻滞于G0／G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）及cyclinB1的mRNA表达水平明显下降。对正常成纤维细胞HSF,50nmol／LcyclinA2-siRNA可抑制58．1％的cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对cyclinA2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclinA2mRNA及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向cyclinA2的siRNA有望成为治疗骨肉瘤的新途径。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素（TSA）对骨肉瘤MG-63的诱导凋亡作用及其机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）曲古抑菌素（TSA）对骨肉瘤细胞株MG-63的杀伤作用及机制。方法以不同浓度的TSA作用于体外培养的骨肉瘤细胞,采用MTF法检测细胞生长抑制率;以流式细胞技术（FCM）测不同浓度TSA作用前后骨肉瘤细胞周期变化情况;免疫细胞化学技术观察对Survivin基因和血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平;RT—PCR分析TSA作用前后骨肉瘤细胞内P21^waf1/cip1mRNA的表达变化。结果TSA在纳摩尔浓度即可抑制细胞增殖;FCM检测到细胞周期发生改变,GJM期细胞较对照组增多。免疫组化结果表明,该药能明显抑制Survivin和VEGF蛋白的表达,RT—PCR结果表示TSA能显著诱导P21waf1／cip1 mRNA表达。上述结果都有明显的量一效关系。结论TSA作用于G州期并有效诱导体外培养的骨肉瘤细胞凋亡,其诱导凋亡机制之一可能是通过抑制Survivin和VEGF基因的表达并且上调P21蛋白水平实现的。     

孕激素对MG-63细胞株孕激素受体和c-fos、c-jun的影响

目的观察18-甲左炔诺孕酮对人成骨肉瘤MG-63细胞株增殖、孕激素受体和c-fos、c-jun表达的影响。方法用不同浓度18-甲左炔诺孕酮干预MG-63细胞株,以不含左炔诺孕酮的MEM培养液作对照,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR测定孕激素受体(PR)、c-fos、c-jun mRNA表达,Western Blot和免疫组化法测定PR、c-fos、c-jun蛋白质的表达。结果与对照组比较,10-10mol/L、10-8mol/L和10-6mol/L左炔诺孕酮分别增加MG-63细胞增殖达7.72%、24.36%和36.54%(P<0.01或P<0.05)。干预24h后,MG-63细胞中PRA、PRB mRNA和蛋白质表达无明显变化(P>0.05)。干预2h后,左炔诺孕酮增加MG-63细胞中c-fos、c-jun mRNA和蛋白质表达(P<0.01或P<0.05),呈剂量依赖性。结论孕激素可能通过增加c-fos、c-jun的表达来促进MG-63细胞增殖。