雄激素受体对前列腺癌PC3细胞株增殖能力的影响

目的研究雄激素受体（AR）对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3增殖能力的影响。方法将含有AR的质粒（Pbabe-AR）稳定转染到PC3细胞,建立起新的细胞系PC3-AR,并用实时逆转录聚合酶链反应（Q—PCR）、蛋白免疫印迹试验（Western blot）和荧光素酶法确认AR的表达水平和功能;用MTT法、软琼脂糖凝胶实验检测AR对体外培养PC3细胞增殖的影响。结果PC3-AR细胞能够稳定表达有功能的AR;MTT实验显示PC3-AR细胞体外生长慢于PC3-v细胞,加入DHT以后效果更加明显。相对于PC3-v,PC3-AR在软琼脂糖凝胶中形成的克隆明显减少。结论AR能够降低PC3-AR细胞在体外的增殖能力。     

腺病毒过表达及siRNA干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I表达的影响

［摘要］　目的　观察腺病毒（Ad-11β-HSD1）过表达系统及特异性siRNA（siRNA-11β-HSD1）干扰人肝癌HepG2细胞对11β-羟基类固醇脱氢酶I（11β-HSD1）表达的影响。方法　应用Ad-11β-HSD1以及siRNA-11β-HSD1转染人肝癌HepG2细胞,用实时荧光定量PCR及Western Blot检测11β-HSD1表达。结果　转染72 h后,对照组及腺病毒过表达组细胞中均可见明显GFP荧光,且转染48 h后蛋白水平明显升高;siRNA干扰48 h后,mRNA及蛋白水平均明显降低。结论　腺病毒转染可有效过表达11β-HSD1,而siRNA干扰可有效抑制11β-HSD1表达。     

MiR-122调控肝癌遗传印记基因PEG10的实验研究

目的 探讨遗传印记基因PEG10功能的异常与miRNA失调控的相关性.方法 通过生物信息学网站TargetScan预测可能参与PEG10调控的miRNA分子,筛选到miR-122.通过基于taqman探针的实时定量逆转录聚合酶链反应,比较miR-122在原代正常肝细胞和3株肝癌细胞株(Huh7,Hep3B,HepG2)中的表达差异.将miR-122的分子前体转染HepG2细胞,观察转染前后PEG10在mRNA和蛋白水平的表达变化.多组均数问比较采用秩和检验,配对样本组间差异比较采用t检验.结果 生物信息学预测结果显示,miR-122可能参与了PEG10的调控.实时定量逆转录聚合酶链反应结果显示,PHHC、Huh7,HepG2、Hep3B细胞miR-122的表达量(2~(-△△Ct)值)分别为1.0578±0.0975、0.5600±0.0632、0.0068±0.0012、0.0058±0.0008,H=9.667,P＜0.05.与原代正常肝细胞相比,miR-122在肝癌细胞株中表现为完全(Hep3B、HepG2细胞)或部分缺失(Huh7细胞),其表达水平与PEG10呈负相关.将miR-122分子前体转入HepG2细胞后,PEG10在mRNA水平并未显示出明显的下调,但Western blot结果提示miR-122分子前体明显抑制了PEG10蛋白的表达.结论 miR-122参与了遗传印记基因PEG10的调控,其调控主要发生在翻译阶段,即蛋白质水平.miRNA的失调控与肝癌的发生密切相关,其功能的异常可能早于受其调控的癌基因或抑癌基因的改变,是肝癌发生的早期事件,这为肝癌的早期预警和基因治疗提供了新思路.     

PEG10基因siRNA真核表达载体对HepG2细胞周期的影响

目的观察针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体对人肝癌HepG2细胞周期及细胞周期调控蛋白表达水平的影响。方法以脂质体法将psiRNA-PEG10真核表达载体转染HepG2细胞，RT-PCR检测PEG10mRNA的表达，流式细胞仪观察细胞周期分布的变化；RT-PCR和Western Blotting法分别检测细胞周期调节蛋白D1（Cyclin D1）和P27mRNA和蛋白水平的表达变化。结果RT-PCR结果显示，转染psiRNA-PEG10的HepG2细胞中PEG10mRNA的表达明显降低；流式细胞仪检测发现，与未转染组和空载体组相比，转染psiRNA-PEG10后处于G0／G1期的HepG2细胞百分比明显升高（P〈0．01），而G2／M期的细胞百分比明显降低（P〈0．01）；在mRNA和蛋白水平上，转染psiRNA-PEG10的细胞Cyclin D1表达明显降低；而P27表达明显升高（P〈0．01）。结论PEG10可通过影响细胞周期调控蛋白CyclinD1和P27表达，干扰肿瘤细胞的细胞周期发挥抗瘤作用，针对PEG10的siRNA真核表达载体有望成为研究肝癌治疗的有力工具。     

siRNA降低COX-2基因表达对肝癌细胞系HepG2增殖的影响

目的: 探讨小干扰R N A 降低环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)基因对肝癌细胞He pG2增殖与细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)表达的影响.方法: 将人肝癌细胞株HepG2细胞分为4组:COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体组、空白对照组. 脂质体转染法将COX-2 siRNA转染入HepG2细胞; MTT法测定转染后24, 48, 72 h的增殖抑制率; 流式细胞仪测定转染后24 h的细胞周期分布; 半定量RTPCR与Western blot检测转染后24 h肝癌细胞COX-2和ERK1/2的表达.结果: COX-2 siRNA干预组的增殖抑制率明显高于阴性对照组和空脂质体转染组(67.08%vs 2.45%, 1.56%, 均P<0.01); COX-2 siRNA干预组G1期细胞明显增多, 与空白组、空脂质体组及阴性对照组相比, 均具有显著差异(72.80% vs 50.27%, 50.97%, 53.13%, 均P<0.05); RT-PCR显示: COX-2 siRNA干预组COX-2, ERK1, ERK2 mRNA表达(0.58, 0.32,0.48)明显降低, 与空白组(0.93, 0.76, 0.72)、空脂质体组(0.89, 0.64, 0.67)及阴性对照组(0.83, 0.71, 0.65)比较, 差异具有统计学意义(均P<0.05), Western blot显示以上各项指标表达趋势与RT-PCR相同.结论: 小干扰RNA可降低肝癌细胞He pG2的COX-2基因表达, 抑制肝癌细胞的生长.COX-2促进肝癌生长可能与ERK1/2通路调控有关.     

遗传印记基因PEG10沉默对人肝癌细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的影响

目的观察靶向封闭遗传印记基因PEG10对人肝癌细胞(HepG2)Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,探讨PEG10促进肝癌形成的可能机制。方法设计针对PEG10基因的shRNA,体外转录制备shRNA后利用脂质体转染技术转染肝癌细胞株HepG2,RT-PCR检测PEG10、β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平,应用免疫组化技术检测其蛋白表达水平。结果转染PEG10-shRNA后HepG2细胞PEG10 mRNA水平下降65.6%,其蛋白表达水平减少60.9%;同时,β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平随之分别下降52.5%、96.1%,蛋白表达水平分别减少94.3%、63.2%。结论靶向封闭PEG10可下调肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin(CTNNB1)、WNT1表达水平。PEG10对肝癌的促进作用可能部分与其影响Wnt/β-catenin通路有关。     

沉默USP9X对肝癌HepG2细胞周期和自噬的作用机制

目的探讨沉默USP9X对肝癌HepG2细胞周期和自噬的作用机制。方法采用siRNA技术沉默USP9X在肝癌HepG2细胞株中的表达,实验分为siRNA组和阴性对照(NC)组;采用MTT法检测细胞增殖率;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用western blot检测细胞中USP9X、LC3-II以及Beclin-1蛋白的表达。结果转染siRNA后,siRNA组中USP9X蛋白表达明显低于NC组(0.44±0.15 vs.1.00±0.00,P0.05);MTT结果表明在HepG2细胞株在沉默24 h、48 h和72 h室的细胞增殖率分别为0.0873±0.0131、0.1047±0.0128和0.1203±0.0148,分别明显低于NC组的0.1113±0.0083、0.1333±0.0062和0.1610±0.0080(P0.05);流式细胞术结果表明在siRNA组中,处于G0-G1期的HepG2细胞数量明显高于NC组(72.32%±1.53%vs.56.30%±3.47%,P0.05),处于S期的HepG2细胞数量明显低于NC组(20.53%±0.66%vs.37.73%±1.82%,P0.05);western blot结果表明siRNA组中的Beclin-1和LC3-II蛋白表达明显高于NC组(1.47±0.19 vs.1.00±0.00,1.48±0.11 vs.1.00±0.00,均P0.05)。结论 USP9X基因沉默可通过阻滞细胞周期进程和诱导细胞自噬进而有效抑制肝癌HepG2细胞的过度增殖。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

The role of androgens and the androgen receptor in cycling endometrium

Androgens and the androgen receptor (AR) are not only required for male reproductive function, they are also essential for female reproductive physiology. Widely expressed in female reproductive tissues, AR levels fluctuate in a regulated manner in the cycling endometrium. Female androgen production depends on the adrenal glands and expression of key enzymes in the endometrium that facilitate local androgen biosynthesis and conversion. Moreover, levels of circulating androgens, in women of reproductive age, fluctuate in a cycle-dependent manner and a mid-cycle peak is associated with conception. AR and androgen signalling have a decisive role in the differentiation of human endometrial stromal cells into decidual cells. Compelling evidence for androgen signalling in the regulation of endometrial function pertaining to implantation and pregnancy is provided by epidemiological studies demonstrating a strong association between polycystic ovary syndrome, premature ovarian failure or advanced maternal age and adverse pregnancy outcome. Thus, androgen signalling is an essential component of normal endometrial physiology and its perturbation is associated with reproductive failure.     

再生障碍性贫血雄激素受体与T细胞亚群的变化

目的:检测慢性再生障碍性贫血(CAA)患者骨髓单个核细胞(MNC)雄激素受体(AR)以及骨髓中T细胞亚群水平,探讨AR在CAA免疫病理机制中的作用。方法:①免疫细胞化学SP法检测CAA患者骨髓MNC内AR的表达水平;②流式细胞术检测CAA骨髓中T细胞亚群(CD3 CD4 细胞、CD3 CD8 细胞)的含量。结果:①CAA患者骨髓MNC中AR阳性水平[(35．18±8．78)个／200个MNC]显著低于对照组[(48．46±9．82)个／200个MNC];不同性别间AR的含量差异无统计学意义。②CAA患者骨髓中的CD3 CD8 细胞含量为(28．54±7．57)％,显著高于对照组。③CAA患者骨髓中的AR阳性水平与骨髓中的CD3 CD8 细胞呈负相关(r=-0．576,P<0．01);而与CD3 CD4 细胞含量未见明显的直线相关关系。结论:CAA患者骨髓AR的表达减少,从而使雄激素刺激造血的作用减弱。患者AR的表达与CD3 CD8 细胞含量呈明显负相关,表明AR的异常可能在一定程度上参与了CAA发病机制中的细胞免疫。     

Androgen sensitivity related proteins in hormone-sensitive and hormone-insensitive prostate cancer cell lines treated by androgen antagonist bicalutamide

Members of the bcl-2 gene family and endogenous inhibitors of cyclin-dependent kinases participate in the regulation of apoptosis and cell cycle in a diverse range of cell types and are implicated in the development of hormone refractory prostate cancer and resistance to anti-cancer therapy. The expression of several of these genes can be regulated by steroid hormones and related agents via their nuclear receptors. However, insufficient information considering the protein expression after the treatment by hormone antagonists is available. The aim of this study was to evaluate the expression of anti- and pro-apoptotic proteins, (Bcl-2, Bax), and to correlate this with the appearance of some nuclear receptors and cell cycle related proteins in androgen sensitive and androgen insensitive prostate cancer cell lines, LNCaP and DU-145, after the treatment by androgen antagonist bicalutamide. Our results revealed that androgen receptor (AR) expression in LNCaP cells decreased, however in DU-145 cells AR slightly increased following anti-androgen treatment. The same agent stimulated expression of p21Waf1/Cip5 and p27Kip1 in LNCaP, as well as in DU-145 cell lines. Bcl-2 level increased slightly in LNCaP cells and, in DU-145 cells was almost undetectable. Bax expression was not changed in LNCaP but significantly decreased in DU-145 cells. Similarly, retinoid X receptor beta (RXRbeta) level was significantly down regulated after 24 hours in DU-145 and also in LNCaP cells after 72 hours. These results confirm that androgen withdrawal therapy employing anti-androgens may elicit different signalling pathways in various types of prostate cancer that may be dependent on AR status and AR sensitivity.     

XAF1基因在肝癌细胞凋亡中的诱导作用

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与凋亡抑制和肿瘤细胞耐药现象密切相关。目的：研究XIAP相关因子1（XAF1）基因抑制人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2增殖和诱导凋亡的作用。方法：以腺病毒Ad5／F35为载体,构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1、对照空病毒Ad5／F35-Null和报告病毒Ad5／F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别以相同感染复数（MOI）感染人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2,并设立空白组作为对照。作用48h后,以荧光显微镜检测Ad5／F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1 mRNA和蛋白表达;以MTT法检测细胞活力;以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率。结果：Ad5／F35-EGFP感染48h后,几乎所有Bel-7404和HepG2细胞均表达EGFP。Ad5／F35-XAF1感染48h后,两种肝癌细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达均明显增高．细胞活力呈剂量依赖性地降低,细胞凋亡率显著增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1在人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2中的感染效率高,XAF1在不同的肝癌细胞株中恢复表达后,能显著抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

Androgen increases androgen receptor protein while decreasing receptor mRNA in LNCaP cells.

We have examined the effect of androgen treatment on androgen receptor mRNA and protein expression in the LNCaP human prostate carcinoma cell line. Incubation with androgen caused a decrease in cellular androgen receptor mRNA content that was concentration and time dependent. Maximal suppression to approximately 35% of control level was observed after 49 h of exposure to androgen. By contrast, incubation of LNCaP cells with androgen resulted in a 2-fold increase in the cellular content of androgen receptor protein at 24 h. At 49 h androgen receptor protein increased 30% as assayed by immunoblots and 79% as assayed by ligand binding. These results suggest that ligand-induced changes in androgen receptor stability and/or the translational efficiency of androgen receptor mRNA account for the phenomenon of androgen receptor upregulation observed in cultured LNCaP cells. Furthermore, the suppression of androgen mRNA and protein that is caused by prolonged incubation with androgen is incomplete and is reversible upon removal of ligand.