人IL-12在昆虫细胞中的表达及其体外生物活性的检测

目的：建立表达具有生物活性的人IL-12 的杆状病毒/昆虫细胞表达系统。方法：将p40和p35 cDNA一起构建入杆状病毒转移载体pAcUW42,然后与杆状病毒AcUW1.lacZ DNA共同转染昆虫细胞Sf9,使两者产生同源重组;随后利用病毒空斑实验筛选重组的杆状病毒,再由ELISA筛选及鉴定表达IL-12的重组病毒,并进行Western Blotting和体外生物活性的检测。结果：经病毒空斑试验、ELISA和Western Blotting逐步阳性选择的IL-12重组杆状病毒,其感染Sf9细胞的上清与IL-12标准品一样具备刺激正常人外周血T淋巴细胞增生的生物活性。结论：本研究建立了能表达具有体外生物活性的人重组IL-12的杆状病毒/昆虫表达系统。     

基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备及初步鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达制备基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒并进行初步鉴定。方法首先将基孔肯雅病毒的结构蛋白基因C-E3-E2-6K-E1克隆入p Fast-Bac~(TM) Dual转移载体中并鉴定;然后将构建正确的重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞后提取重组杆粒并鉴定;再将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒,并利用免疫荧光法(IFA)鉴定其感染Sf9细胞后E2蛋白的表达;最后通过透射电镜(TEM)和Western-Blot鉴定CHIKV病毒样颗粒。结果成功获得了含有CHIKV结构蛋白基因的重组杆状病毒,该重组病毒经过IFA及WB验证在昆虫细胞中能够表达CHIKV的E蛋白,并在电镜下观察到了直径约60~80 nm的CHIKV病毒样颗粒。结论通过杆状病毒表达系统成功表达并获得CHIKV的病毒样颗粒,为CHIKV早期快速检测法的建立奠定基础。     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。     

蚯蚓纤溶酶PI_(239)基因在杆状病毒中的表达

利用基因重组技术将PI2 39基因通过细菌 /杆状病毒 (Bac to Bac)表达系统构建重组杆状病毒表达载体 ,载体采用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 ,将重组病毒转染昆虫Sf9细胞 ,细胞出现明显病变。SDS PAGE电泳可以见到相对分子质量 3 .0万位置有蛋白表达 ,免疫印记结果表明该条带可以与PI2 39抗体反应。提示蚯蚓纤溶酶PI2 39重组蛋白已经获得表达 ,为进一步研究蚯蚓纤溶酶PI2 39基因的生物学活性奠定了基础     

利用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达人CYP2E1

目的获得人CYP2E1重组酶,并用该重组酶的特征性探针底物对其进行代谢活性研究.方法以人肝组织RNA为模板,通过RT-PCR得到CYP2E1 cDNA片断,然后与pFastBac质粒连接,得到pFastBac-CYP2E1重组质粒,将其转化E.coli DH 10Bac大肠杆菌,通过转座作用,获得重组Bacmid-CYP2E1,将其转染草地夜蛾细胞(Sf9) 后,产生重组杆状病毒.将该病毒以及分别含有人CYPOR和人CYPb5的病毒共同感染Sf9细胞,收集共表达蛋白,以氯唑沙宗为底物鉴定重组酶的活性.结果利用细菌/杆状病毒系统得到重组人CYP2E1的表达,其对氯唑沙宗的Km值为(72.4±8.7)μmol·L-1,Vmax值为(2.41±0.10)μmol·min-11·g-1蛋白.结论利用杆状病毒系统成功表达了有催化活性的人CYP2E1重组酶,其活性与文献报道值相似.     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

重组人Versican G1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的：利用杆状病毒．昆虫细胞表达系统制备人蛋白聚糖Versican G1区(VG1)的重组蛋白。方法：将编码人VG1蛋白343个氨基酸的基因插入pFastBacl载体，转化大肠杆菌DH10Bac，提取重组Bacmids转染Sf9昆虫细胞，获取含重组人VG1蛋白的杆状病毒进一步感染昆虫细胞进行蛋白表达。通过Ni—NTA层析柱对重组蛋白进行纯化。免疫印迹方法对昆虫细胞培养上清中的蛋白成分进行鉴定，采用透明质酸结合实验确定重组人VG1蛋白的生物活性。结果：人VG1基因在昆虫细胞中获得高水平表达，重组人VG1蛋白具免疫原性和与透明质酸结合的生物活性。结论：昆虫细胞表达的重组人VG1蛋白具有良好的免疫原性和生物活性。     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。     

杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFkB)启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒,分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFkB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。     

HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.     

抗β淀粉样肽40人单克隆抗体在昆虫细胞分泌表达

目的通过杆状病毒昆虫细胞系统重组表达抗β淀粉样肽40人单克隆抗体,为全人抗体治疗阿尔茨海默病创造条件。方法将抗β淀粉样肽40人单链抗体重链可变区和轻链可变区分别克隆插入pAC-L-CH3的多克隆位点,构建成pAC-VH-VL表达质粒。将表达质粒和BaculoGold共转染SF9细胞后,用免疫荧光方法进行人IgG表达的检测。将感染重组杆状病毒的昆虫细胞培养液上清过蛋白A-琼脂糖亲和层析柱,洗脱纯化出的抗体经过SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白质。结果杆状病毒昆虫细胞系统抗β淀粉样肽40人单克隆抗体表达质粒pAC-VH-VL构建成功。将表达质粒和辅助病毒感染昆虫细胞后可见昆虫细胞表达人抗体。经过蛋白A-琼脂糖亲和层析,从昆虫细胞培养基中纯化出抗β淀粉样肽40人单克隆抗体。结论通过基因工程手段在人抗Aβ40抗体可变区羧基端连接人抗体恒定区片段,通过杆状病毒昆虫系统分泌表达并纯化获得完整的人抗Aβ40单克隆抗体。     

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的：构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒，包装重组LMP1的杆状病毒，感染昆虫细胞进行表达。方法：先将已克隆的LMP1 cDNA与线性化的pFastBACHTb进行连接，使pFASTBACHTb-LMP1与DHl0BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid／LMPl克隆，提取Bacmid／LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒，利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达，通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot检测表达情况。结果:获得了重组LMP1的杆状病毒，细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白，分子量为63kDa左右，细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论:LMPl能在昆虫细胞中获得良好表达，为研究肿瘤疫苗及LMPl在EBV致瘤分子机理中的作用奠定了基础。     

蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的重组杆状病毒载体。方法 将目的基因（EGFP和GDNF）克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达。结果 目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达。结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染Sf9细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。     

OPCML基因在杆状病毒—昆虫细胞表达系统中的表达

目的：利用杆状病毒表达系统行OPCML基因在Sf9昆虫细胞中表达。方法：以OPCML-PWPI为模板,利用PCR方法扩增OPCML基因,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经Western-blot检测表达产物。结果：OPCML-PACGp67A质粒转染Sf9细胞后,在相对分子质量约37 000处有一条新生蛋白带经检测为OPCML蛋白。结论：OPCML基因成功在Sf9细胞中得到表达。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法 将目的 基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果 目的 基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

人碱性成纤维细胞生长因子在昆虫细胞sf9中的表达

将人碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)基因cDNA克隆到pFastBacI转移载体中 ,重组质粒转化到感受态细胞DH1 0Bac中 ,使目的基因转座入BacmidDNA中 ,纯化DNA后 ,利用病毒噬斑实验筛选重组的杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,在Sf9细胞中进行表达。Western印迹结果表明 :表达产物为相对分子质量约 1 70 0 0的蛋白 ,与预计的重组蛋白相对分子质量相同 ,并具有较好的免疫学活性。MTT检测证实表达产物能明显促进人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的分裂增生 ,具有hbFGF的生物学活性