外周血中CD44＋CD24-/^low乳腺癌干细胞对化疗药物反应性的临床研究

目的探讨乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24-/low乳腺癌干细胞对化疗药物的反应性。方法分别采集30例健康志愿者和30例初治乳腺癌患者化疗前后的外周静脉血液各10ml,流式细胞术（FCM）检测CD44＋CD24-/low细胞含量,比较⑴健康志愿者与乳腺癌患者CD44＋CD24-/low细胞数量的差异;⑵乳腺癌患者化疗前后CD44＋CD24-/low细胞数量的变化。结果⑴30例健康志愿者外周血中CD44＋CD24-/low乳腺癌干细胞为0～21个/105,中位数为13个/105;⑵30例初治乳腺患者化疗前、后,其外周血中CD44＋CD24-/low乳腺癌干细胞比例和中位数,分别为5～35个/105和21个/105、2～48个/105和33个/105;⑶健康志愿者与乳腺癌患者,以及乳腺癌患者化疗前后,外周血中CD44＋CD24-/low细胞数量的差异皆有统计学意义（P〈0.05）。结论⑴乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24-/low乳腺癌干细胞比例高于健康志愿者;⑵化疗药物可使乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24-/low乳腺癌干细胞比例升高;⑶乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24-/low细胞比例可能会成为一项临床治疗效果的判断指标。     

ABCG2、CD44、CD24及CD44＋/CD24-细胞在乳腺浸润性导管癌组织中的表达

目的 观察ABCG2、CD44、CD24及CD44＋/CD24-细胞在乳腺浸润性导管癌中的表达意义.方法 应用免疫组化双染技术检测60例乳腺浸润性导管癌组织中CD44＋/CD24-细胞的表达并应用单染方法检测ABCG2、CD24、CD44的表达情况,同时以60例癌旁组织及30例乳腺增生症组织作对照.结果 CD44＋/CD24-细胞在乳腺癌、癌旁及乳腺增生症组织中均有表达.CD44＋/CD24-细胞与CD44表达呈正相关（r=0.304,P＜0.05）,与ABCG2、CD24表达无相关性（P＞0.05）.乳腺癌组织 ABCG2表达与无瘤生存期相关（P＜0.05）.CD24在复发及间质无淋巴反应者中阳性表达高于无复发及间质有淋巴反应者（P＜0.01及0.05）.结论 CD44＋/CD24-细胞表达并非乳腺癌组织特异性,其与CD44表达呈正相关;ABCG2阴性患者无瘤生存期长;CD24高表达易复发.     

乳腺癌组织中干细胞CD44＋／CD24-表型与预后的关系

目的探讨CD44＋／CD24-表型与病理类型、临床病理特征的及乳腺癌预后生存情况的关系。方法应用免疫组织化学CD44／CD24双染方法检测100例乳腺癌CD44／CD24双染的情况,分析CD44＋／CD24-表型情况及其与病理类型、临床病理及生存情况的相关性。结果CD44＋／CD24-细胞表型阳性患者和阴性患者在年龄,绝经状况,病例分级,临床分期,肿瘤直径大小,淋巴结转移状况,复发状况,雌激素受体（ER）与孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子受体-2（HER2）等临床病例参数均差异无统计学意义（P〉0．05）。CD44＋／CD24-细胞表型阳性组与阴性组中位生存时间比较发现两组生存时间无统计学差异（x2=0．017,P=-0．897）。结论乳腺癌CD44＋／CD24-细胞表型表达情况与乳腺癌生存时间无相关性。     

rAAV/CEA转染树突状细胞诱导特异性CTL杀伤MCF-7细胞系CD44+ CD24-/low乳腺癌干细胞

目的:携带癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)基因的重组人腺相关病毒(reconstructive human ade-no-association virus,rh-AAV)感染树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导获得抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic lymphocyte,CTL),体外检测其对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果。方法:分离供者外周血单个核细胞,以细胞因子白介素-4(interleukin-4,IL-4)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimu-lating factor,GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导培养获得DC,细胞因子白介素-2(interleukin-2,IL-2),刺激培养获得T淋巴细胞。含CEA基因的rh-AAV感染培养DC,诱导成熟后将DC和T细胞混合培养获得CTL细胞。流式分选MCF-7和MA-MDB-231细胞系中CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,MTT法检测CTL细胞对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤效果。结果:MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low亚群比例分别为5.1%和76.3%。CEA基因转染DC诱导的CTL细胞对表达CEA抗原的MCF-7杀伤率为46.5%±15.0%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.009);对MCF-7细胞中分选的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的杀伤率为44.7%±28.2%,明显高于未转染组。对非乳腺癌干细胞杀伤率为50.6%±22.2%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P=0.05)。在不表达CEA基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞,CEA转染诱导的CTL细胞对未分选细胞、分选的CD44+/CD24-/low亚群和非干细胞亚群的杀伤率与未转染的对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:携带CEA基因rh-AAV转染DC诱导产生的抗原特异性CTL细胞可杀伤表达CEA的乳腺癌细胞,对CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞也具有一定的杀伤活性,提示免疫治疗可能是治疗乳腺癌干细胞潜在有效的手段。     

MDA-MB-453细胞中分离CD44+/CD24-/low和SP细胞及其Wnt和Notch通路状态分析

目的:通过分离人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)过表达乳腺癌细胞MDA-MB-453中的CD44 /CD24-/low和SP(side population)细胞亚群,探索其干细胞表型,同时分析其SP细胞亚群与wnt和Notch信号传导通路中的关键蛋白([β-catenin和Notch-1)基因扩增的关系,研究其SP细胞亚群与HER2和人类表皮生长因子3(human epidermal growth factor 3,HER3)基因扩增的相关性.方法:应用流式细胞技术,检测HER2过表达乳腺癌细胞MDA-MB-453和HER2阴性细胞MCF-7是否存在CD44 /CD24-/low细胞亚群和SP细胞亚群.应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法检测MDA-MB-453细胞中母β-catenin和Notch-1的基因扩增情况,粗略比较在MDA-MB-453细胞及其SP细胞亚群中β-catenin,Notch-1,HER2和HER3蛋白基因扩增量的差异.结果:MDA-MB-453细胞系未检测到CDM44 /CD24-/low细胞亚群,但可检测出SP细胞亚群.在MDA-MB-453细胞和MCF-7细胞均可扩增到β-catenin和Notch-1.β-catenin和Notch-1的基因扩增在MDA-MB-453细胞中低于其SP细胞哑群;然而,HER2和HER3的基因扩增在两个细胞亚群中是类似的.结论:SP细胞能够富集MDA-MB-453乳腺癌干细胞.wnt和Notch信号通路在MDA-MB-453细胞中处于开放激活状态,这些信号传导通路可能与MDA-MB-453乳腺癌干细胞的维持和活性相关.     

肿瘤干细胞标记物CD44-＋CD24-（low/-）与MMP-9在乳腺癌组织中的表

目的研究肿瘤干细胞标记物CD44＋CD24low/-以及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达与肿瘤临床病理参数之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测109例乳腺癌组织中的CD44、CD24及MMP-9的表达并对结果进行分析。结果（1）109例乳腺癌组织中CD44、CD24及MMP-9的表达率分别是47.7%、50.5%及40.4%,其中CD44的阳性表达率与乳腺癌病理分级密切相关（P〈0.05）;（2）109例乳腺癌组织中,CD44＋CD24low/-肿瘤干细胞标记阳性例数为32例,随乳腺癌病理分级的升高,CD44＋CD24low/-肿瘤干细胞比率也明显增加（P〈0.05）;（3）32例CD44＋CD24low/-肿瘤干细胞标记阳性乳腺癌组织中,MMP-9蛋白的表达与淋巴结转移成负相关（P〈0.05）。结论高度恶性乳腺癌组织中富于肿瘤干细胞,乳腺癌早期CD44＋CD24low/-TSC中MMP-9蛋白表达增加可能对肿瘤干细胞（TSC）生长及浸润中起着一定作用。     

CD44^＋/CD24^-表型在乳腺癌分子亚型中的表达和分布

目的：研究CD44＋/CD24-表型在乳腺癌中的表达并探讨其与乳腺癌各分子亚型的相关性.方法：根据免疫学标志物（ER,PR,HER2,CK5/6,P53）把217例乳腺癌划分为5类分子亚型：basal-like型、LuminalA型、LuminalB型、Her2过表达型和Normalbreast-like型.应用双重免疫组织化学检测CD44/CD24双染的情况,分析CD44＋/CD24-表型与乳腺癌5个分子亚型的相关性.结果：217例乳腺癌病例中,luminalA型130例、luminalB型15例、HER2过表达型21例、basal-like型29例、Normalbreast-like型22例.38%的乳腺癌组织表达CD44＋/CD24-表型,CD44＋/CD24-表型在basal-like型、Lu-minalA型、LuminalB型、Her2过表达型、Normalbreast-like型乳腺癌中表达率分别为69.0%,36.2%,26.7%,19.0%,31.8%.CD44＋/CD24-表型在乳腺癌各分子亚型中的表达具有显著差异性（P=0.003）,高表达在basal-like乳腺癌中（69%）.结论：CD44＋/CD24-乳腺癌干细胞与basal-like乳腺癌有相关性; 其他乳腺癌干细胞标志物仍需得到进一步鉴定.     

三阴性乳腺癌组织中肿瘤干细胞相关标记物CD44~+/CD24~(-/low)和ALDH1+的表达及意义

目的:探讨三阴性乳腺癌(TNBC)组织中乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenases l,ALDH1)和CD44~+/CD24~(-/low)的表达及其与临床预后的关系。方法:通过免疫组织化学SP法检测ALDH1和CD44~+/CD24~(-/low)等生物学指标在30例三阴性乳腺癌(TNBC)术后石蜡切片组织和30例非三阴性乳腺癌术后石蜡切片组织中的表达,并分析其与TNBC的临床预后因素的关系。结果:TNBC组织中ALDH1+表达率为46.67%,CD44~+/CD24~(-/low)阳性表达率为56.67%;非三阴性乳腺癌组织中ALDH1+表达率为16.67%,CD44~+/CD24~(-/low)阳性表达率为26.67%,TNBC组织中ALDH1和CD44~+/CD24~(-/low)阳性表达率明显高于非三阴性乳腺组织,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。腋窝淋巴结转移率在CD44~+/CD24~(-/low)与ALDH1均阳性表达组和非阳性表达组中分别为66.67%和23.81%(χ~2=4.983,P=0.035);局部复发和/或转移率分别为33.34%和0(χ~2=7.778,P=0.021)。结论:TNBC组织中ALDH1+和CD44~+/CD24~(-/low)过表达,可以作为判断TNBC患者预后的标记物。     

乳腺癌干细胞的检测及Hedgehog信号通路关键分子的表达

目的:探讨乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中是否存在乳腺癌起始细胞(CD44+/CD24-/low)亚群;并分析Hedgehog信号通路在CD44+/CD24-/low乳腺癌起始细胞亚群中的表达.方法:应用荧光激活细胞分选方法检测与分选MCF-7和MDA-MB-231中的CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群,并在激光共聚焦显微镜下进行观察确认.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CD44+/CD24-/low细胞亚群和非CD44+/CD24-/low细胞亚群中Hedgehog信号通路重要基因PTCH(human patched gene)、SHH(sonic Hedgehog)、Gii-1(glioma-associated oncogene homoglog-1)和SMOH(smoothened homolog)的表达情况.结果:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中CD44+/CD24-/low亚群,比例分别为(1.70±1.43)%和(94.2±1.2)%.乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的CD44+/CD24-/low亚群中Hedgehog信号通路处于明显活化状态,其中Hedgehog信号通路中重要下游信号分子Gii-1在MCF-7和MDA-MB-231细胞系CD44+/CD24-/low细胞亚群中的表达要明显高于非CD44+/CD24-/low细胞亚群(P分别为0.007和0.005).结论:乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中存在CD44+/CD24-/low干细胞标志细胞亚群,其中Hedgehog信号通路处于明显活化状态.     

乳腺癌干细胞微球体形成的影响因素

目的:探讨MCF-7、MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞微球体形成的影响因素,并检测其中CD44+/CD24-/low的表达.方法:将MCF-7、MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞进行微球体培养.取培养第7天的微球体细胞,用流式细胞术分析干细胞比例.结果:MCF-7形成微球体的效率最高(2.1%±0.3%),MDA-MB-231很少能形成微球体,原代乳腺痈细胞中未观察到微球体形成.但在无B27的干细胞培养环境中,MCF-7易贴壁生长.MCF-7单层培养细胞中CD44+/CD24-/low的比例为2.0%±0.1%,将悬浮及贴壁来源的McF-7细胞进行微球体培养,微球体细胞中CD44+/CD24-/low的比例分别为11.8%±0.3%和8.2%±0.8%(P<0.01).MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+/CD24-/low的表达比例分别为92.2%±3.1%和93.8%±2.4%.结论:MCF-7细胞通过微球体培养富集了肿瘤干细胞,而MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞则不能.MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+/CD24-/low的表达与微球体形成不呈正相关.     

ALDH1+、CD44+/CD24-重叠与乳腺癌基因亚型和临床因素相关性研究

 目的比较ALDH1⁺和CD44⁺/CD24^-做为人乳腺癌干细胞标志物时在基因亚型中的分布和与临床相关因素方面的异同,并了解两种标志物互补后在基因亚型中的分布和临床因素的相关性。方法采用免疫组织化学单染、双染技术检测203例未接受放化疗乳腺癌患者肿瘤组织中重叠表达ALDH1⁺、CD44⁺/CD24^-表型的情况。结果所有乳腺癌组织中重叠表达ALDH1⁺/CD44⁺/CD24^-表型为5.4%,主要存在于HER-2（18.2%）型和Triple negativ型（45.5%）,病理类型主要为浸润性导管癌,2年无病生存率低于其它表型（P <0.05）。结论只有很小一部分乳腺癌患者为ALDH1⁺/CD44⁺/CD24^-/low表型,主要存在于Triple negative型,病理类型主要为浸润性导管,2年无病生存率低。ALDH1⁺和CD44⁺/CD24^-可能标志不同层次的乳腺癌干细胞,未来采用免疫组织化学技术互补检测ALDH1⁺和CD44⁺/CD24^-可能预测患者预后。 结果显示,ALDH1⁺表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、病理类型、ER,PR等临床相关变量分布差异无统计学意义（P >0.05）,而与临床分期有关（P <0.05）;CD44⁺/CD24^-、ALDH1⁺/CD44⁺/CD24^-表型与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结状态、ER,PR等临床相关因素分无明显相关性（P >0.05）,而与病理类型有关（P <0.05）,见表2。     

乳腺癌干细胞在无血清培养基K-SFM中的有效富集

摘要:CD24+/CD24-已被证实是乳腺癌干细胞的标记,该群细胞具有致瘤性、克隆形成及转移潜能。但在癌组织中或细胞系中含量极小,对其有效分离及纯化方法的缺乏已成为研究干细胞的主要障碍。本研究应用改良的无血清培养基K-SFM能在乳腺癌原代细胞及已建立的乳腺癌细胞系中体外有效富集CD24+/CD24-细胞群,对乳腺癌干细胞相关基因的检测显示Oct-4、ABCG2、Nanog和N-cadherin显著上调,而E-cadherin显著下调。 方法 1．乳腺癌细胞系培养 人乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3在含20 ng/ml 表皮生长因子(EGF; R and D Systems, Minneapolis, MN), 5 μg/ml 胰岛素, 0.4% 牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis, MO) 的K-SFM无血清培养基中培养,对照组为含10%小牛血清RPMI 1640培养基培养。37˚C、5%二氧化碳浓度下,恒湿培养箱培养。 2．乳腺癌组织标本原代培养 乳腺癌标本在离体30分钟内获取,进行机械分离,部分需酶消化。用30μm 柱状微孔过滤,制成单细胞悬液,以1000个/ml分别于RPMI-1640全培养基和K-SFM无血清培养基中培养。培养方法同上。 3．流式细胞分析与分选 收集上述方法培养的细胞系以及原代培养细胞,通过流式检测乳腺癌干细胞分子标记CD44+/CD24-/low,确定培养方法对于富集干细胞的有效性。同时通过荧光分选 (FACS),富集CD44+/CD24-/low样细胞制成单细胞悬液。 4．定量RT-PCR分析 收集流式细胞仪分选的K-SFM无血清培养基中细胞及对照分化细胞,提取RNA,通过实时定量 RT-PCR检测干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin的表达,以GAPDH作为内参。 结果 在MCF-7细胞系观察到微球体的形成,制成单细胞悬液,应用乳腺癌干细胞表面标记CD44+/CD24-/low标记,经流式细胞仪分选发现MCF-7中干细胞标记细胞占17.3%,较含血清培养基中干细胞比例（0.5%）增加了34.6倍;而 SKBR-3干细胞比例占17.4%,较对照组（0.9%）高28倍。且实时定量 RT-PCR检测显示该群细胞大量表达干细胞相关基因Oct-4, ABCG2, Nanog 和N-cadherin。在人乳腺癌组织作原代培养也得出相似结论。     

核基质结合区结合蛋白SATB1上调乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的表达

 目的  探讨核基质结合区结合蛋白,富含A-T序列特异性结合蛋白1(special A-T rich sequence binding protein 1,SATB1)对乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的影响及机制。 方法  用SATB1相关小干扰RNA(SATB1 related small interfering RNA,SATB1-siRNA)双链寡核糖核酸干扰MDA-MB-231细胞;pEGFP-N1 -SATB1-GFP真核表达质粒瞬时转染MCF7细胞后,流式细胞术检测SATB1对乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-表达的影响。结果  MCF7细胞转染SATB1后,表达CD44+/CD24-的细胞比例明显升高;MDA-MB-231细胞在SATB1-siRNA干扰后,表达CD44+/CD24-的细胞比例明显降低(P<0.05)。结论  SATB1可能在形成并维持乳腺癌肿瘤干细胞特性中起重要作用。     

CD44~+/CD24~-细胞在乳腺癌细胞中所占比例及相关性分析

目的探讨CD44＋/CD24-细胞在乳腺癌细胞中的比例与乳腺癌远处转移之间的关系,研究其与各临床资料之间是否存在相关性。方法通过免疫组化双染技术,对60例病例的肿瘤石蜡切片进行分析,确定CD44＋/CD24-细胞在乳腺癌细胞中所占的百分率,并分析其与远处转移之间的关系及与各项临床资料间的关系。结果 CD44＋/CD24-细胞占肿瘤细胞百分比在两组中存在显著差异性,转移组中骨转移病例的CD44＋/CD24-细胞在肿瘤细胞中的比例有显著性差异。结论 CD44＋/CD24-细胞细胞在乳腺癌细胞中所占比例与乳腺癌远处转移密切相关,特别是骨转移。在临床病理类型,肿瘤大小,淋巴结转移情况,TNM分期,激素受体情况,肿瘤发生于绝经前后,Her-2情况中无明显差别。     

A novel mouse model of human breast cancer stem-like cells with high CD44^＋CD24^–/lower phenotype metastasis to human bone

Background A satisfactory animal model of breast cancer metastasizing to bone is unavailable. In this study, we used human breast cancer stem-like cells and human bone to build a novel “human-source” model of human breast cancer skeletal metastasis.
Methods Human breast cancer stem-like cells, the CD44^＋/CD24^-/lower subpopulation, was separated and cultured. Before injection with the stem-like cells, mice were implanted with human bone in the right or left dorsal flanks. Animals in Groups A, B, and C were injected with 1×10^5, 1×10^6 human breast cancer stem-like cells, and 1×10^6 parental MDA-MB-231 cells, respectively. A positive control group （D） without implantation of human bone was also injected with 1×10^6 MDA-MB-231 cells. Immunohistochemistry was performed for determination of CD34, CD105, smooth muscle antibody, CD44, CD24, cytokine, CXC chemokine receptor-4 （CXCR4）, and osteopontin （OPN）. mRNA levels of CD44, CD24, CXCR4, and OPN in bone metastasis tissues were analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR）.
Results Our results demonstrated that cells in implanted human bones of group B, which received 1×10^6 cancer stem-like cells, stained strongly positive for CD44, CXCR4, and OPN, whereas those of other groups showed no or minimum staining. Moreover, group B had the highest incidence of human bone metastasis （77.8%, P=0.0230） and no accompaniment of other tissue metastasis. The real-time PCR showed an increase of CD44, CXCR4, and OPN mRNA in metastatic bone tissues in group B compared with those of groups C and D, however the expression of CD24 mRNA in group B were the lowest.
Conclusions In the novel “human source” model of breast cancer, breast cancer stem-like cells demonstrated a higher human bone-seeking ability. Its mechanism might be related to the higher expressions of CD44, CXCR4, and OPN, and the lower expression of CD24 in breast cancer stem-like cells.