体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化的特征

目的：骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现具有重要的临床应用价值，可用其作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞，以解决供体缺乏，同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多问题。为此，实验模拟肝脏发育的微环境，观察体外诱导分化大鼠骨髓干细胞为肝干细胞的可行性及特征。 方法：实验于2006—10／2007-08在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成。①实验动物：SPF级SD大鼠，2月龄，体质量（200&;#177;20）g，雌雄不拘，购于上海斯莱克实验动物公司。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度分离法分离培养大鼠骨髓干细胞，并设诱导组和非诱导组，应用25μg／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维生长因子-4、10μg／L干细胞生长因子共同诱导。③实验评估：于诱导第0，7，14，21，28天，观察细胞形态变化，采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度，免疫组织化学染色检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的表达，应用流式细胞仪检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19表达阳性细胞比例。 结果：①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变。②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高，第14天达高峰，随后呈下降趋势，与非诱导组相比，除第O，7天无差异，其余各时间点差异均显著（P〈0．05）。③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白，非诱导组不表达3种蛋白。④流式细胞分析诱导组甲胎蛋白阳性细胞比例为66．20％、细胞角蛋白19阳性细胞的比例为44．96％。 结论：在实验建立的诱导培养体系中，骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞，诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

背景骨髓基质细胞是贴壁黏附的非造血多潜能干细胞,其在一定条件体外培养、扩增可被诱导分化为神经元和胶质细胞.目的观察家猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化成神经干细胞的生长情况.设计随机取样.单位南方医科大学附属珠江医院神经外科.材料实验于2002-01/12在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行,实验动物是由第一军医大学动物中心提供健康家猫20只,年龄1.0～2.0岁,体质量2.5～4.0 kg,雌雄各半.干预随机抽取家猫左右下肢的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,提取的骨髓基质细胞悬液在体外给予神经干细胞培养基培养,增殖后用维甲酸为分化诱导因子进行诱导骨髓基质细胞向神经干细胞转化.CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS,JAPAN)追踪观察活细胞培养生长情况,同时观察4,12,24,48 h去除非贴壁细胞及不去除贴壁细胞骨髓基质细胞生长情况.采用免疫组织化学染色改良法对干细胞阶段的骨髓基质细胞进行免疫细胞化学检测,OLYMPAS光学显微镜观察.主要观察指标对接受实验干预的骨髓基质细胞分别进行倒置相差显微镜下观察活细胞生长情况及光镜下观察免疫细胞化学染色情况.结果20只家猫全部进入结果分析.猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大,倒置相差显微镜下可见丰富的胞浆颗粒,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养.免疫组化染色分析结果显示能表达神经干细胞特异性抗原Nestin,而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞.结论家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,在合适条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞.     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等,而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢?目的研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效.设计以细胞为研究对象,重复观察测量,探索性研究.单位一所医学院病理生理学教研室.材料实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠.方法通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养,流式细胞仪检测其表面抗原表达,多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志.主要观察指标①MSCs分离和扩增结果.②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果.结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.流式细胞仪检测结果显示CD14,D11α,D34,D38,D45,D80,D86为阴性,D29,D44,D90,D105,D166呈阳性.黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3 h后大部分MSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性,胶质纤维酸性蛋白阴性.结论SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的诱导条件下,可以分化为神经元样细胞.     

骨髓间充质干细胞治疗糖尿病研究进展

糖尿病已成为严重危害人类健康的疾病之一。目前,移植胰岛治疗糖尿病已初见疗效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排异反应而受阻,离广泛临床应用还有一定的距离。骨髓间充质干细胞(bone m arrow m esenchym a l stem ce lls,BM-M SCS)取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,且具有跨越分化潜能,可望解决细胞来源和免疫排异问题。本文通过回顾最近的文献,根据BM-M SCS定向诱导分化、自体移植和联合移植三种方法总结了这方面的进展。1 BM-M SCS定向诱导分化为胰岛细胞BM-M SCS是骨髓中除造血干细胞以外的另一种多能干细胞,它既可分化为造…     

自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足20例的护理

我科于2004—06／2006—06共对20例糖尿病足患者采用自体骨髓干细胞移植治疗，取得一定的疗效，护理体会如下。1临床资料1．1一般资料本组男15例，女5例，年龄45～70岁，糖尿病史8--17a。     

自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足临床观察

[目的]观察自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的临床疗效.[方法]2009年3月至2010年5月,应用自体骨髓干细胞移植治疗16例糖尿病足患者.手术首先抽取自体骨髓200～300 mL,从中分离出单个核细胞悬浊液约40 mL,行下肢缺血肌肉内局部注射.[结果]移植后大部分患者下肢疼痛、麻木、冷感、间歇性跛行均有不同程度缓解...     

骨髓间充质干细胞定向诱导成类软骨细胞的实验研究

背景：用组织工程的方法修复软骨缺损克服了传统方法的诸多不足。目的：体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。设计：完全随机设计，对照实验研究。单位：哈尔滨医科大学组胚教研室及神经生物教研室。材料：Wistar大鼠(清洁级动物)6只，雌雄不限，来源于哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(黑)20020002。方法：取第二代成年大鼠骨髓间充质干细胞，实验组用无血清培养液诱导；对照组用含10％胎牛血清的培养液自然分化。Ⅱ型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色检测其分化情况。主要观察指标：软骨细胞的鉴定，不同诱导时间Ⅱ型胶原免疫组化阳性率的比较。结果：诱导后的MSCs具有软骨细胞的特点。结论：成年大鼠骨髓间充质干细胞在特定的培养基能向软骨细胞方向转化，作为软骨组织工程种子细胞具有可行性。     

骨髓干细胞向肝系细胞分化的研究进展

骨髓干细胞主要有两大类,一类是造血干细胞,另一类是骨髓间充质干细胞。近年研究表明,这两类干细胞在一定条件下可分化为多种组织细胞,包括肝系细胞。分化为肝系细胞的研究为肝脏疾病的治疗提供了新的细胞来源。     

缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：观察缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞形态学特征。方法：将缺血性脑血管病患者自体骨髓中的阃充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM—MSCs）经密度梯度离心法分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的形态。结果：原代培养的BM—MSCs最佳贴壁时间为3d，生长性状不一，呈散在圆形细胞群、散在梭形细胞群、克隆圆形细胞群、花带状细胞群、漩涡状细胞群，而传代培养的细胞，增殖速度较快，性状一致，排列规则，呈饱满的梭行。结论：通过体外非诱导培养获得的自体BM—MSCs，有较强的增殖能力和多向分化潜能，为缺血性脑血管病的临床治疗提供了实验依据。     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

背景：骨髓基质细胞是贴壁黏附的非造血多潜能干细胞，其在一定条件体外培养、扩增可被诱导分化为神经元和胶质细胞。目的：观察家猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化成神经干细胞的生长情况。设计：随机取样。单位：南方医科大学附属珠江医院神经外科。材料：实验于2002-01／12在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行，实验动物是由第一军医大学动物中心提供健康家猫20只，年龄1．0～2．0岁，体质量2．5～4．0kg，雌雄各半。干预：随机抽取家猫左右下肢的骨髓，从中分离得到骨髓基质细胞，提取的骨髓基质细胞悬液在体外给予神经干细胞培养基培养，增殖后用维甲酸为分化诱导因子进行诱导骨髓基质细胞向神经干细胞转化。CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS，JAPAN)追踪观察活细胞培养生长情况，同时观察4，12，24，48h去除非贴壁细胞及不去除贴壁细胞骨髓基质细胞生长情况。采用免疫组织化学染色改良法对干细胞阶段的骨髓基质细胞进行免疫细胞化学检测，OLYMPAS光学显微镜观察。主要观察指标：对接受实验干预的骨髓基质细胞分别进行倒置相差显微镜下观察活细胞生长情况及光镜下观察免疫细胞化学染色情况。结果：20只家猫全部进入结果分析。猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大，倒置相差显微镜下可见丰富的胞浆颗粒，继之出芽，贴壁生长，可形成克隆团，同时可传代培养。免疫组化染色分析结果显示能表达神经干细胞特异性抗原Nestin，而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞。结论：家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征，在合适条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞。     

骨髓移植造血重建过程中干／祖细胞增殖特性的研究

为了探讨骨髓移植造血重建过程中干/祖细胞增殖的特性,我们采用病理形态学、BMNC计数、抗5-FU BMNC计数、外源性CFU-S(12)和骨髓连续移植等方法,对造血重建过程不同阶段的干/祖细胞增殖特性,进行了动态的对比研究。实验结果表明,在移植后第3天,骨髓内可见少数淋巴样细胞呈小灶性分布,第5—9天细胞灶迅速扩大,细胞形态表现为淋巴样细胞,至第11天才出现不同阶段的分化细胞;第5—9天BMNC数和抗5-FU BMNC数迅速增加,随后增殖速度明显减缓;第9天骨髓的CFU-S(12)数和重建长期造血的能力高于第5天和21天的骨髓。本实验结果提示,骨髓移植后造血细胞呈小灶性分布,重建造血初期造血干/祖细胞迅速增殖而无明显分化表现,此阶段骨髓细胞的重建长期造血能力增强,提示造血干细胞有扩增。     

不同年龄段人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

本研究通过对不同年龄段人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)的研究探讨MSC生物学特点与年龄的关系,从而为临床寻找合适供体,迅速获取所需MSC提供实验依据。骨髓供体按年龄分为4组:A组(胚胎)、B组(0-20岁)、C组(20-40岁)和D组(40岁以上)。观察各组骨髓MSC的生长、增殖、分化特点;用流式细胞仪检测细胞表面标志,用ELISA方法检测培养上清造血相关因子的水平;进行核型分析及成瘤试验;评价不同年龄段供体骨髓MSC在临床造血干细胞移植中的应用价值。结果显示:各组骨髓均可培养出MSC,各组MSC表面标志无显著差异;各组MSC均具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力;原代培养B组骨髓MSC含量较多,贴壁时间早,传代时间短,P0至P1时间为5.5天,传至P10需33天,8×106MNC培养至P10时MSC数达(5.19±2.15)×1010;A、C、D组P0至P1时间分别为15、7和13天,传至P10分别需50、60和72天,8×106MNC培养传代至P10时MSC数分别为(4.98±2.08)×1010、(1.86±0.47)×1010、(0.64±0.22)×1010。A组MSC较细长,细胞融合后生长无接触抑制,P15增殖速度开始减缓;B、C、D组MSC形态相似,有生长接触抑制B组P10开始增殖减缓,C、D组P8开始增殖减缓;B组MSC培养上清中SCF、FLT3L、IL6及SDF1水平高于其它各组。各组间细胞的增殖指数无显著差异。核型分析均为正常核型,成瘤实验为阴性。结论:MSC增殖生长特性与年龄密切相关;根据临床造血干细胞移植的需要,0-20岁年龄组骨髓是短时间内获取足够细胞数的理想供体,分泌HGFs水平亦占优势;0-20岁组骨髓MSC的生物学特性优于其他各组,可以作为MSC的供源。     

人骨髓间充质干细胞支持体外造血

体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统,其中的细胞成分是该系统的关键。存在于骨髓中的间充质干细胞（ＭＳＣｓ）是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞,在造血调控中可能具有一定的作用。本研究首先建立了成人骨髓ＭＳＣｓ的分离及体外培养的方法,并应用长期骨髓细胞培养体系,观察了ＭＳＣｓ滋养层体外维持长期培养启动细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）的能力及其促进造血细胞分化的功能     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是否能体外诱导分化为心肌样细胞。方法用浓度梯度法分离和纯化Wistar大鼠MSCs，贴壁法培养，培养的第2代细胞分别用终浓度为0、0．1、1．0、10．0、50．0、100．0μmol／L的5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导分化，用光学显微镜观察细胞的形态并用免疫细胞化学方法鉴定细胞内的心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）。结果以终浓度10．0μmol／L 5-aza为诱导组，细胞从原来的梭形变为排列趋向较为一致的长梭形，且体积增大，诱导10d后，细胞内cTnI蛋白染色阳性。终浓度为0、0．1、1．0μmol／L组细胞形态变化不明显，细胞内cTnI染色阴性。终浓度为50．0、100．0μmol／L组细胞死亡。结论大鼠MSCs细胞可经5-aza诱导分化为心肌样细胞，且5-aza的最佳诱导浓度为10．0μmol／L。     

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用，采用RT—PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM—MSC)造血因子的表达，以及氢化考的松对BM—MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示，体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM—MSC均能表达SCF，Flt3-ligand TPO,LIF,IL—6和IL—11等重要的造血细胞因子，但不表达G—CSF，GM—CSF和IL-3。不同代数的BM—MSC细胞，造血细胞因子的表达相同。BM—MSC经氢化考的松作用7—21天后，可谤手G—GSFmRNA表达，但不诱导GM—GSF的表达，细胞在形态学上也未发生明显改变。结论：体外培养的正常人和本组血液病病人BM—MSC具有促造血功能。     

骨髓干细胞移植治疗骨不连及骨缺损临床研究

目的观察自体骨髓干细胞移植治疗骨不连及骨缺损的疗效。方法140例患者随机分为自体髂骨移植组(A组)及自体骨髓干细胞移植组(B组)各70例,均行手术治疗,并行简单有效的内外固定。结果术后平均愈合时间A组为(7.0±2.0)个月,B组为(5.0±1.5)个月,两组间有显著性差异(P<0.05);治疗期间患者无明显不良反应。结论自体骨髓干细胞移植较传统植骨治疗骨不连及骨缺损疗程短、疗效好,无不良反应。     

骨髓内皮细胞产生造血抑制因子

本研究探讨骨髓内皮细胞分泌的造血抑制因子在扩增造血祖细胞中的作用并初步探讨其作用机制。收集无血清骨髓内皮细胞条件培养液 (BMEC CM) ,离心超滤 ,获得 >1 0kD和 <1 0kD的组分 ,以观察BMEC CM原液及其 >1 0kD和 <1 0kD组分对CFU GM及HPP CFC的增殖作用的影响 ;检测骨髓内皮细胞及BMEC CM中抑制因子的表达 ,用抗体中和实验检测BMEC CM中的抑制因子对造血集落的抑制活性 ;用膜杂交法检测抑制因子联合造血刺激因子扩增造血细胞时增殖与分化相关基因的改变。结果表明 :①BMEC CM ,>1 0kD及 <1 0kD组分分别加入集落培养体系 ,BMEC CM对CFU GM及HPP CFC的生成无明显影响 ,>1 0kD组分增加CFU GM及HPP CFC的生成 ,<1 0kD组分抑制CFU GM及HPP CFC的生成。②BMEC CM ,>1 0kD及 <1 0kD组分分别加入骨髓细胞液体培养体系培养 2 4小时后 ,BMEC CM组CFU GM明显减少 ,HPP CFC显著增加 ;>1 0kD组分组CFU GM明显增加 ,HPP CFC无显著改变 ;<1 0kD组分组CFU GM及HPP CFC均明显减少。③小鼠骨髓内皮细胞表达MIP 2 ,MIP 1α ,MSP ,TGF β,TNF α,IFN γ及Tβ4。BMEC CM中存在有MIP 2 ,MIP 1α ,MSP ,TGF β ,TNF α和Tβ4。④抗体中和实验结果表明在BMEC CM中的TGF β ,MSP ,MIP 1α,IFN γ和Tβ4有明显抑制活性。⑤Tβ4     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究

本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理,以传统的全骨髓贴壁法为基础,探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法。采用6孔板培养细胞,将骨髓标本用MSC完全培养液培养48h,吸取上层无红细胞的上清层,置于新的培养孔以分离获取MSC。用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况,记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间。并以传统全骨髓贴壁法为对照;应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记;用油红0及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定;应用计数板计数法描绘第1代,第3代,第5代MSC增殖曲线。结果表明,用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44,低表达CD14、CD45、CD34;细胞周期中G0／G1期88．76％,G2／M期3．04％,S期8．2％,符合干细胞周期特征;增殖曲线呈典型”S”型;油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性。同时与传统方法相比,改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法（P=0．0004）,首次贴壁时间短（P〈0．0001）、首次传代时间短（P=0．001）。结论：骨髓标本培养48h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC,改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法。