缺失HPI毒力岛的EAggEC O42突变菌株的构建及鉴定

目的 构建并鉴定HPI毒力岛缺失的EAggEC突变株。方法 运用基因重组方法,以irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列,irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列,中间插入有卡那霉素(Km)抗性基因(kan)标记。以pCVD442作为载体,构建含有irp8部分序列和irp5基因的重组自杀质粒pCO85。以EAggECO42为出发菌株,构建缺失irp8～irp5约24kb的HPI毒力岛功能核心区区域的全岛缺失株EAG85。结果 通过接合转移和同源重组,利用蔗糖抗性筛选,pCO85上的同源序列有效的置换了EAggECO42的irp8和irp5基因。PCR方法扩增irp3、ybtA、irp9等基因的结果显示,筛选出的EAG85确为缺失HPI毒力岛基因的EAggEC菌株。结论 成功地构建了缺失HPI毒力岛的EAggECO42突变菌株,为进一步阐明HPI毒力岛在EAggEC菌株中的功能建立了重要的物质基础。     

耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体的构建

目的 构建耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,为进一步构建HPI全岛缺失株打下基础。方法根据已知小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因序列设计PCR引物,扩增并克隆irp8结构基因,作为同源重组的一侧序列,以irp5的部分序列作为同源重组的一侧序列,并将之克隆入同一载体,中间插入有卡那霉素(Km)基因(kan)、抗性标记。以自杀质粒pcvD442为载体．构建了含有irp8基因和Irp5部分序列的缺失突变载体pCO85。结果构建的突变载体经酶切及PCR鉴定克隆片段大小与预期一致。结论成功构建了致耶尔森菌HPI毒力岛全岛缺失突变载体,这个以小肠结肠炎耶尔森菌为靶序列构建的重组自杀质粒可应用于肠杆菌科及其他菌属HPI毒力岛全岛缺失株的构建。     

大肠埃希菌MG1655 Lon蛋白酶编码基因敲除株的构建

目的构建Lon蛋白酶编码基因缺失的大肠埃希菌（E．coli MG1655）菌株。方法PCR扩增基因序列,该序列两端与Lon蛋白酶基因部分序列同源,中间部分为氯霉素抗性基因。电转化法将该片段转入大肠埃希菌MG1655。利用宿主菌-大肠埃希菌MG1655内pKIM6编码的入重组系统,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因-Lon编码基因。氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,琼脂糖凝胶电泳和DNA测序两种方法鉴定lon敲除突变株。结果氯霉素抗性平板成功筛选出重组菌株,基因检测结果表明Lon编码基因被氯霉素抗性基因替代。结论本研究通过该方法成功获得了E．coliMG1655蛋白酶编码基因lon敲除突变株,为探讨大肠埃希菌Lon在牙菌斑形成中的作用奠定了基础。     

携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛大肠杆菌的毒力基因分析

目的探索HPI毒力岛阳性大肠杆菌的毒力基因存在情况。方法使用PER和杂交技术对152株HPI毒力岛阳性的大肠杆菌进行相关毒力基因检测。结果在152株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中，基本上未栓出常见的5类致泻性大肠杆菌的毒力基因，但是部分菌株检出泌尿道致病性大肠杆菌PAI毒力岛基因yc73和prrA以及RTX毒力岛基因rtx615。结论这些大肠杆菌和已知的致泻性大肠杆菌有明显不同，携带HPI毒力岛的大肠杆菌可能包括几个不同的群，可能存在其它的尚未发现的毒力因子，有必要继续进行进一步研究。     

国内首次发现携带耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因的阴沟肠杆菌

目的 研究感染性腹泻患者粪便中分离的阴沟肠杆菌携带的小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因,并评价其菌株的毒力和耐药情况.方法 PCR扩增法检测毒力岛irp-2基因,小白鼠腹腔注射法检测毒力,药敏试验采用K-B纸片扩散法.结果 从感染性腹泻患者粪便中分离的9株阴沟肠杆菌均扩增出irp-2基因片段,其相对分子量与对照菌株小肠结肠炎耶尔森菌WA株(O8型)的相应PCR片段一致,并具有较强的毒力.结论 检出的阴沟肠杆菌含有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因且为具有毒力的菌株,与致病性密切相关.     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF 基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD 33质粒为载体的espF
基因回补实验平台。方法设计1 对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46 质粒的
EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核
苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采
用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录。结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的
EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用
Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回
补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础。
     

B型链球菌数量感应通路测定及LuxS缺失突变株的构建

目的对GBS中可能存在的AI-2数量感应通路进行测定，构建数量感应相关分子LuxS缺失突变株并对其基因型进行确认。方法培养GBS至不同D（λ）值．利用V．harveyi BB170作为报告菌株，对GBS诱导生物发光的能力进行测定，然后寻找GBS中LuxS同源基岗，通过同源重组法在GBS中构建LuxS缺失突变株，Southern杂交分析确证。结果GBS中的某种分泌成份可在报告菌株中诱导生物发光活性，提示GBS中存在AI-2数量感应通路，在GBS中发现了LuxS同源基因并成功地构建了LuxS缺失突变株。结论本研究为探索LuxS在GBS中AI-2数量感应通路中的重要性及GBS毒力研究建立了细菌模型     

PhoB缺失突变株的构建及其性状的初步研究

目的为探索B族链球菌（group B streptococcus，GBS）的毒力全局性调控机制，对GBS中的双组分信号传导调控系统PhoR—PhoB的成分之一PhoB的功能进行了初步研究。方法首先应用计算机软件对GBS基因组进行分析，寻找PhoB同源基因，接着通过同源交换法在GBSⅠa515和V2603菌株中构建PhoB缺失突变株，并通过Southem杂交分析对其基因型进行了确证，通过RT—PCR法、菌落印迹分析、生长曲线测定等方法对其表型特性进行了初步研究。结果在GBS中发现了PhoB同源基因并成功地在GBSⅠa515和V2603菌株中构建了PhoB缺失突变株ΔPhoB，对其基因型、表型特性及功能的初步研究结果表明此突变株为非极性缺失突变株，其缺失突变不影响其下游基因的表达；此缺失突变不影响GBS在THY及CDM培养基中生长速度的改变。结论在GBS中构建并确证了非极性PhoB基因缺失突变株，为GBS中毒力全局性调控机制的进一步研究提供了有利的工具。     

三种细菌HPI核心区ybtE基因核苷酸序列及推导氨基酸序列的比较研究

目的比较三种肠聚集性大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌HPI毒力岛核心区ybtE基因的同源性。方法PCR扩增肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)17-2ybtE基因的完整序列,克隆后测序。用ABIPRISM软件对该ybtE基因序列与已知的鼠疫耶尔森菌HPI的ybtE基因以及小肠结肠炎耶尔森菌HPI的irp5基因进行核苷酸序列和推导氨基酸序列比较。结果核苷酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和98.2%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为98.2%;推导氨基酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和97.6%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为97.8%。结论ybtE基因作为HPI的功能基因高度保守,EAEC中的HPI可能来源于YpsHPI。     

产毒性和致病性大肠杆菌中小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛的检测

目的 了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中的分布，探讨毒力岛在大肠杆菌中的结构和功能。方法 对毒力岛的关键基因irp2,fyua和asn-intB进行PCR扩增和DNA测序，并对irp2和fyua进行原位杂交。结果 在检测的93株肠产毒性大肠杆菌的10株肠致病性大肠杆菌基因irp2的检出率分别为32.25%(30/93)和30%（3/10),fyua的阳性率为21.51%(20/93)和30%（3/10）。而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到天门冬氨酸tRNA(asntRNA）位点。结论 小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠肝菌中较高的阳性率，对于大肠杆菌毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化可能具有重要意义。     

产毒性和致病性大肠杆菌中小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛的检测

目的　了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中的分布,探讨毒力岛在大肠杆菌中的结构和功能。方法　对毒力岛的关键基因irp2、fyua和asn-intB进行PCR扩增和DNA测序,并对irp2和fyua进行原位杂交。结果　在检测的93株肠产毒性大肠杆菌和10株肠致病性大肠杆菌基因irp2的检出率分别为32.25％（30/93）和30％（3/10）,fyua的阳性率为21.51％（20/93）和30％（3/10）,而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到天门冬氨酸tRNA（asn tRNA）位点。结论　小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中较高的阳性率,对于大肠杆菌毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化可能具有重要意义。     

PCR检测ETEC中的irp1基因

目的：探讨高致病岛（High Pathogenility Island,HPI)的irp1基因在ETEC菌株中的分布状况。方法：利用小肠结肠耶尔森菌HPI的irp1基因,设计合成引物,对ETEC菌株进行PCR（多聚酶链反应）检测。结果：94株ETEC菌中有10株呈现阳性。结论：HPI的irp1基因在小肠结肠炎耶尔森菌与ETEC（肠致病性大肠杆菌）之间存在着基因的水平转移,但其转移机制如何及转移过程有待于进一步研究。     

非编码 RNA GlmY 对伤寒沙门菌生物膜形成的影响

目的: 探究非编码 RNA GlmY 对伤寒沙门菌生物膜形成的影响及其分子机制。方法: 用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法,制备 glmY 缺陷株;用96孔微量板结晶紫染色法检测各菌株生物膜形成情况;通过qRT PCR分析glmY 缺陷株及野生株中生物膜形成相关基因的mRNA表达水平。结果： 成功制备glmY缺陷株;细菌生物膜形成实验表明,与野生株相比,glmY缺陷株生物膜形成能力明显下降;qRT PCR分析结果显示,GlmY缺失后卷曲菌毛合成相关基因csgD和csgA的mRNA表达水平明显下调。结论： 伤寒沙门菌非编码 RNA GlmY可通过上调csgD和csgA的表达促进卷曲菌毛合成,进而促进生物膜的形成。     

黑暗链霉菌tobS1-C基因缺失突变株的构建

通过敲除妥布霉素生物合成基因tobS1-C,定向选育阿泊拉霉素高产菌株。PCR扩增tobS1-C基因上下游同源序列和红霉素抗性基因ermE,构建穿梭载体pSH6,利用接合转移法转化黑暗链霉菌Tt49,经同源重组,敲除tobS1-C两基因序列,共2484 bp,获得框内删除突变株黑暗链霉菌T103(△tobS1-C)。发酵验证表明突变株不再合成妥布霉素,只合成阿泊拉霉素。     

产毒性大肠杆菌（ETEC）中毒力岛分布的研究

目的 了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中的分布,以便于进一步深入研究毒力岛在大肠杆菌中的结构的完整性和功能。方法 PCR扩增和原位杂交及基因序列分析,结果 在检测的93株产毒性大肠杆菌（ETEC）的毒力岛的检出率为32.25%(32/93),而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到asntRNA(天门冬氨酸tRNA0位点。结论 产毒性大肠杆菌是致病性较强的病原菌之一,而小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性大肠杆菌中阳性率较高的分布。对于进一步研究产毒性大肠杆菌的毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化具有重要意义。