谷氨酸受体调节剂对N2a细胞中DISC1及Camk2γ的影响

目的观察谷氨酸受体调节剂对小鼠神经瘤N2a细胞中精神分裂症断裂基因1(DISC1)及钙/钙调素依赖性蛋白激酶2γ(Camk2γ)的影响。方法将N2a细胞随机分为4组(n=6),分别加入DMSO(D组,对照组)、1μmol/L氯胺酮(K组)、2μmol/L MK-801(M组)及2μmol/L NBQX(N组)。采用Western blotting检测DISC1及Camk2γ表达。结果与D组相比,K组及M组DISC1表达下调,N组DISC1表达上调(P<0.05);K组及M组Camk2γ下调,N组Camk2γ下调(P<0.05)。结论谷氨酸受体调节剂影响小鼠神经瘤N2a细胞中DISC1及Camk2γ的表达,这可能与谷氨酸受体调节剂诱发精神分裂样不良反应有关。     

同型半胱氨酸对小鼠成神经瘤细胞毒性作用研究

Objective: To explore the neurotoxicity of homocysteine on mouse neuroblastoma cells (N2a) and its effect on pERK1/2 protein level. Methods: Cultured N2a cells were divided into four groups according to the concentrations of homocysteine: control group (0 μmol/L), low-Hcy (30 μmol/L), moderate-Hcy (300 μmol/L), high-Hcy (1 000 μmol/L) groups. After 72 h Hcy treatment, the toxicity of N2a cells was detected by LDH (lacate dehydrogenase) assay kit, cell proliferation ability was detected by MTT methods, and the protein expression of pERK1/2 was detected by western blot. Results: The LDH activity in Hcy-treated groups was increased compared with control group (P<0.05). The cells proliferation ability was decreased after Hcy treatment, and OD values were reduced compared with control group (P<0.05). The protein expression of pERK1/2 decreased after Hcy treatment, and significant differences among the moderate, high Hcy dose groups and control group were found (P<0.05). Conclusion: The toxic effect of Hcy on N2a cells may be caused by reduced ERK1/2 protein phosphorylation expression. It suggests that a low serum Hcy level may have a protective effect on neural cells.     

同型半胱氨酸对小鼠成神经瘤细胞毒性作用研究

目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)对小鼠成神经瘤细胞(N2a)毒性作用并探讨其对p ERK1/2蛋白表达的影响。方法:培养的N2a细胞加入不同浓度Hcy,随机分为4组:分别为正常对照组及Hcy低、Hcy中、Hcy高浓度组,根据预实验结果确定以上4组Hcy干预浓度分别为0、30、300和1 000μmol/L。作用72 h后,用酶标仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法检测细胞增殖情况,蛋白质免疫印迹法检测N2a细胞p ERK1/2蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,Hcy低、中、高浓度组细胞培养液中LDH活性均显著升高,差异具有统计学意义(P值分别为0.013、0.008和0.011,P<0.05)。低、中、高浓度Hcy作用后,MTT检测细胞增殖活力下降,OD值降低,与对照组比较,差异具有统计学意义(P值分别为0.01、0.006和0.009,P<0.05)。各Hcy干预组p ERK1/2蛋白表达量降低,且中、高浓度Hcy组p ERK1/2蛋白表达量与对照组相比差异具有统计学意义(P值分别为0.038、0.007,P<0.05)。结论:Hcy能抑制磷酸化的ERK1/2蛋白表达,从而对N2a产生毒性作用,进而抑制N2a增殖,提示降低血清中Hcy水平可以对神经细胞产生保护作用。     

高迁移率族蛋白N2抗裸鼠宫颈癌移植瘤的作用研究

目的 研究高迁移率族蛋白N2（high mobility group chromosomal protein N2,HMGN2）对宫颈癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 建立宫颈癌裸鼠移植瘤模型,随机分为阴性对照组、HMGN2蛋白组、顺铂组和联合用药组,分别予生理盐水、HMGN2蛋白、顺铂、HMGN2蛋白加顺铂隔日腹腔注射。观察肿瘤的生长情况,经过4次给药后处死裸鼠,取出瘤块,测量其体积计算抑瘤率,并行苏木精-伊红（HE）染色观察形态学变化。结果 成功建立宫颈癌裸鼠移植瘤模型。第4次给药后,HMGN2蛋白组、顺铂组、联合用药组肿瘤体积平均值分别为（0.14±0.07） cm₃、（0.11±0.06） cm₃ 、（0.11±0.07） cm₃,与阴性对照组〔（0.38±0.12） cm₃〕相比差异有统计学意义（P <0.05）;3组肿瘤体积平均值的差异无统计学意义（P >0.05）。 HMGN2蛋白组、顺铂组、联合用药组肿瘤抑制率分别为0.62±0.18、0.71±0.17、0.70±0.18,差异无统计学意义（P >0.05)。肿瘤经肉眼观察可见阴性对照组瘤块较大,HE染色可见HMGN2蛋白组、顺铂组和联合用药组细胞坏死较阴性对照组明显。结论 HMGN2 蛋白可以明显抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。     

可用于中医药系统研究的药物高内涵筛选分析

药物高内涵筛选分析是系统生物学时代的一项领先技术,具有活体、动态、多指标的综合特点,能够全面反映细胞组学的整体变化,非常适用于中药的复杂成分组成和多靶点作用途径的研究。因此,积极将该技术应用于中医药研究,对发现中药的有效组分和毒性成分,阐明中药的复杂作用机制,促进中医药理论的发展均有重要意义。     

扶正抑瘤颗粒药物血清诱导小鼠肝癌细胞凋亡及其机制的研究

目的:研究中药复方扶正抑瘤颗粒药物血清对小鼠肝癌H22细胞凋亡的影响及其作用机制.方法:采用扶正抑瘤颗粒药物血清,温育体外培养的H22小鼠肝癌细胞.流式细胞仪进行细胞周期分析,检测凋亡率;透射电镜观察细胞超微结构变化;链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin peroxidase complex,SABC)免疫细胞化学法观察凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化.结果:扶正抑瘤颗粒药物血清可影响细胞周期,使小鼠肝癌H22细胞的增殖阻滞在G1/G0期,并可测到凋亡峰,同时可下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达(扶正抑瘤颗粒药物血清组与空白对照组比较,P<0.05).结论:扶正抑瘤颗粒可通过影响细胞生长周期,调节Bcl-2和Bax蛋白的表达诱导小鼠肝癌细胞凋亡.     

川芎嗪通过干预Bax/Bcl2平衡调控Caspase9途径抑制谷氨酸诱导的PC-12细胞凋亡

目的:通过制作谷氨酸诱导的PC-12细胞损伤模型,进一步探讨川芎嗪影响凋亡的作用机制。方法:应用细胞毒性试验,确定细胞模型中谷氨酸浓度;进而,应用不同浓度的川芎嗪同时处理PC-12细胞,采用荧光燃料Hoechst-33258染色直接观察细胞核的改变,采用流式细胞术检测细胞凋亡和Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9活性,最后应用实时荧光定量RT-PCR检测Bax和Bcl2转录水平。结果:谷氨酸具有细胞毒性,其半数抑制浓度(ID50)是21.72mmol/L;川芎嗪呈剂量依赖性的提高细胞存活率。谷氨酸诱导的PC-12细胞以中晚期凋亡为主,但川芎嗪处理后,PC-12细胞凋亡率显著降低(P<0.05),且以早期凋亡为主。川芎嗪处理谷氨酸细胞模型后,Caspase-8活性未见显著改变(P>0.05),但在1mmol/L和10mmol/L川芎嗪干预组,Caspase-3和Caspase-9活性显著降低,同时伴随Bax/Bcl2比值显著降低(P<0.05)。结论:谷氨酸通过Caspase9而不是Caspase8途经活化Caspase3诱导凋亡;川芎嗪通过干预Bax/Bcl2平衡调控Caspase9途径抑制谷氨酸诱导的PC-12细胞凋亡。     

miR-124-3p通过负调控Caveolin-1表达N2a/APPswe细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度

目的：探讨在阿尔茨海默病（Alzheimer’s diseases,AD）细胞模型中miR-124-3p通过调控Caveolin-1的表达对细胞凋亡率及钙离子浓度的影响。方法：体外培养野生型N2a（N2a/WT）和N2a/APPswe细胞,real-time PCR及Western blot分别检测miR-124-3p与β-淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）mRNA及蛋白的表达。双荧光素酶报告实验分析miR-124-3p与Caveolin-1之间靶向调控关系。N2a/APPswe细胞瞬时转染miR-124-3p模拟物（mimics）,real-time PCR、Western blot分别检测Caveolin-1 mRNA和蛋白的表达。N2a/APPswe细胞分别瞬时转染miR-124-3p模拟物（mimics）、pcDNA-Caveolin-1、Caveolin-1-siRNA,流式细胞仪分析细胞凋亡水平,测定细胞内游离钙离子浓度。结果：与WT组相比,APPswe组APP mRNA和蛋白水平表达都明显升高（分别为P=0.000,P=0.000）,miR-124-3p表达明显降低（P=0.000）。双荧光素酶报告实验表明,和与突变型载体（pGL3-Caveolin-1 3’UTR MUT）共转染组相比,与野生型载体（pGL3-Caveolin-1 3’UTR WT）共转染组的相对荧光素酶活性和明显减弱（P=0.004）;转染miR-124-3p mimics后,与空载体组比较,miR-124-3p mimcs转染组的Caveolin-1 mRNA和蛋白的表达明显下调（分别为P=0.000,P=0.000）;分别转染miR-124-3p mimics、Caveolin-1-siRNA后,与空载体组比较,细胞凋亡率降低（分别为P=0.000,P=0.000）,游离钙离子浓度降低（分别为P=0.000,P=0.000）;转染pcDNA-Caveolin-1后,得到与上述相反的结果（分别为P=0.000,P=0.000）。结论：miR-124-3p可以通过靶向下调Caveolin-1的表达,抑制AD细胞凋亡,降低细胞中游离钙离子浓度,从而发挥神经保护作用,为AD的防治提供新的思路和靶点。     

鼠妊娠晚期服谷氨酸单钠对仔鼠脑Bax和Bcl-2表达的影响

目的　主要观察母鼠经口给予谷氨酸单钠 ig对仔鼠大脑皮层和海马神经元 Bax和 Bcl- 2表达的改变 ,探讨谷氨酸的兴奋毒性作用 ;并观察鼠大脑皮层和海马神经元 Bax的改变与 Bcl- 2表达的改变是否有互动关系 .方法　妊娠 17～2 1d的昆明系小鼠经口 ig,给予谷氨酸单钠 (4 mg· g- 1 ) ,仔鼠产后第 10 ,2 0和 30日采用免疫组织化学方法检测了 Bax/Bcl- 2在鼠脑皮层和海马组织中的表达 .细胞损伤采用镜下细胞直接计数法 .结果　胚胎期摄入谷氨酸可引起 10 ,2 0和30日龄仔鼠大脑皮层、海马 CA1,CA2 ,CA3和 CA4区神经元 Bax表达的增高 (d10 . 36 .0 vs16 .6 ,47.0 vs2 6 .0 ,74.0vs2 5 .0 ,34 .3vs2 1.3,42 .6 vs2 2 .0 ,P<0 .0 5 ;d2 0 . 2 7.0 vs2 0 .0 ,31.0 vs 9.7,5 2 .3vs 17.0 ,2 6 .5 vs 10 .0 ,6 3.7vs2 2 .0 ,P <0 .0 5 ;d30 . 2 5 .0 vs 9.7,32 .0 vs 10 .0 ,38.3vs14.7,2 6 .0 vs10 .0 ,31.7vs9.7,P<0 .0 5 ,cells· 0 .0 6 33mm- 2 ) ,而相应地 ,10 ,2 0日龄仔鼠脑皮层和海马 CA1,CA2 ,CA3和 CA4区神经元 Bcl- 2的表达比正常鼠明显降低(d10 . 13.7vs44 .7,12 .0 vs37.7,2 3.0 vs6 1.7,11.0 vs31.0 ,18.7vs5 1.7,P<0 .0 5 ;d2 0 . 14.0 vs36 .7,14.0 vs32 .7,19.0 vs 43.7,10 .3vs 2 7.3,19.3vs 34     

Generation and characterization of a cold-adapted attenuated live H3N2 subtype influenza virus vaccine candidate

Background H3N2 subtype influenza A viruses have been identified in humans worldwide, raising concerns about their pandemic potential and prompting the development of candidate vaccines to protect humans against this subtype of influenza A virus. The aim of this study was to establish a system for rescuing of a cold-adapted high-yielding H3N2 subtype human influenza virus by reverse genetics, Methods In order to generate better and safer vaccine candidate viruses, a cold-adapted high yielding reassortant H3N2 influenza A virus was genetically constructed by reverse genetics and was designated as rgAA-H3N2. The rgAA-H3N2 virus contained HA and NA genes from an epidemic strain A/Wisconsin/67/2005 （H3N2） in a background of internal genes derived from the master donor viruses （MDV）, cold-adapted （ca）, temperature sensitive （ts）, live attenuated influenza virus strain A/Ann Arbor/6/60 （MDV-A）. Results In this presentation, the virus HA titer of rgAA-H3N2 in the allantoic fluid from infected embryonated eggs was as high as 1：1024. A fluorescent focus assay （FFU） was performed 24-36 hours post-infection using a specific antibody and bright staining was used for determining the virus titer. The allantoic fluid containing the recovered influenza virus was analyzed in a hemagglutination inhibition （HI） test and the specific inhibition was found. Conclusion The results mentioned above demonstrated that cold-adapted, attenuated reassortant H3N2 subtype influenza A virus was successfully generated, which laid a good foundation for the further related research.     

大黄素诱导白血病KG-1a细胞凋亡及对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响

目的本研究观察大黄素(emodin)对人急性髓系白血病KG-1a细胞的增殖及凋亡影响,探讨Bcl-2/Bax基因在其中的作用。方法采用四唑蓝比色试验(MTT)检测大黄素对KG-1a细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化与凋亡情况;RT-PCR法检测大黄素作用后细胞Bcl-2/Bax mRNA表达的变化。结果大黄素能抑制KG-1a细胞的增殖,作用48 h的半数抑制浓度(IC50)约为171.8μmol/L流式细胞仪分析出现典型的亚二倍体峰(凋亡峰),将细胞阻滞于G0/G1期,大黄素作用后KG-1a细胞Bcl-2基因表达下调,而Bax基因表达上调,并呈量效关系。结论大黄素可诱导KG-1a细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2,上调Bax基因表达水平有关。     

甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立

目的构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对。结果本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101~102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47%~4.03%),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪。结论本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构。     

miR-916a调控SOCS6促进HBx-HepG2细胞生长

目的 探讨HBx-HepG2细胞中miR-196a对细胞因子信号抑制物6(SOCS6)表达的调控作用以及对细胞生长的促进作用,并研究其潜在的分子作用机制。 方法 利用qRT-PCR检测miR-196a以及SOCS6 mRNA的表达水平;Western blotting检测SOCS6蛋白表达水平;CCK-8和集落形成实验检测细胞的生长;采用双荧光素酶报告实验验证miR-196a的靶基因。 结果 与正常人肝细胞(L02)相比, miR-196a在HBx-HepG2细胞中过量表达(P<0.05)。miR-196a过表达可促进HBx-HepG2细胞生长;miR-196a表达下调可抑制HBx-HepG2细胞生长,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常人肝细胞(L02)相比, SOCS6 mRNA在HBx-HepG2细胞中表达下调(P<0.05);miR-196a可以通过作用于SOCS6的3'UTR区负向调控其表达, 并且SOCS6 的过表达可以抑制HBx-HepG2细胞的生长。 结论 miR-196a可以通过靶向负调控SOCS6基因进而促进HBx-HepG2细胞的生长。     

黄芩素对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及miR-34a在其机制中的作用

目的:观察12-脂氧合酶抑制剂黄芩素(Baicalein)对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,并初步研究miR-34a在黄芩素影响HepG2细胞机制中的作用.方法:黄芩素(浓度分别为25、50和100 μmol/L)作用HepG2细胞24 h和48 h后,分别用Hoechst33342染色后荧光显微镜观察HepG...     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

肝细胞生长因子体外对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对肝癌细胞 HepG2 增殖和凋亡的影响. 方法: 人肝癌细胞株 HepG2加入不同浓度HGF(0, 1, 10, 50 μg/L) 培养2, 4, 6 d,应用MTT 法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡百分率的变化,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达. 结果: HGF 抑制 HepG2 细胞增殖呈剂量及时间依赖性,并诱导其凋亡[50 μg/L HGF,培养时间为4, 6 d,其抑制率: (30.7±10.2)%, (49.8±11.1)% vs 1 μg/L HGF: (10.7±11.2)%, (4.2±9.4)%; P《0.05, P《0.01]. 随着HGF浓度增大S期细胞明显减少[试验组10, 50 μg/L HGF: (7.5±4.4)%, (7.8±1.6)% vs对照组0 μg/L HGF: (16.6±2.8)%; P《0.05, P《0.01],同时可见G0/G1 期细胞累积现象[试验组10, 50 μg/L HGF: (80.5±3.2)%, (73.1±3.9)% vs对照组0 μg/L HGF:(59.6±6.2)%; P《0.05, P《0.01]. 试验组 G1 峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率亦较对照组显著增加(P《0.05). 且试验组细胞 PCNA 表达明显高于对照组. 结论: HGF 对肝癌细胞 HepG2 有抑制增殖和诱导其凋亡的作用,诱导细胞 G0/G1 期阻滞为可能机制之一.     

Ras分子信号蛋白调控睾丸间质细胞Cox7a2蛋白表达及共定位影响研究

目的：研究Cox7a2与Ras分子蛋白的共定位特点,探讨迟发性性腺功能障碍（late onset hypogonadism,LOH）的分子信号调控机制。 方法：构建Cox7a2及Ras正义及点突变体荧光表达载体,鉴定后转染细胞,荧光显微镜观察Cox7a2及Ras蛋白的共定位特点。结果：Cox7a2的线粒体定位能被Wt-Ras所干扰,N17-Ras突变体转染细胞,Cox7a2恢复线粒体定位,提示Cox7a2和N17-Ras之间可能存在相互作用。结论：Cox7a2对睾酮合成的调控可能与Ras相关信号通路有关,Ras可能是调控靶点之一。     

DC-CIK细胞对人肝癌HEPG2细胞周期、凋亡的影响

目的 探讨细胞因子从肝癌患者外周血贴壁单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)诱导的树突状细胞( dendritic cells,DCs)与杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)对人肝癌HEPG2细胞系周期、凋亡的影响.方法 用肝癌患者肝...