BMP-2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad -BMP - 2 )转染的人骨髓基质干细胞 (hBMSC) ,复合PLA/PCL(聚乳酸 /聚己内酯 )生物降解支架体外构建组织工程骨。方法　用Ad -BMP - 2转染体外培养的成人BMSC ,免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP - 2的表达 ,并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,hBMP - 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达 ;S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad-BMP - 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA/PCL上生长良好 ,BMP - 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

BMP—2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA／PCL支架体外构建组织工程骨

目的 用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体(Ad—BMP—2)转染的人骨髓基质干细胞(hBMSC)，复合PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)生物降解支架体外构建组织工程骨。方法 用Ad—BMP—2转染体外培养的成人BMSC，免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP—2的表达，并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 转染后，hBMP—2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达；S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论 Ad—BMP—2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA／PCL上生长良好，BMP—2基因治疗的组织工程骨构建成功。     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

透明质酸复合人骨形态发生蛋白-2转染兔骨髓基质干细胞的体内外成骨研究

目的观察透明质酸(HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白(AdvhBMP)2基因转染的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的体内外诱导成骨活性。方法(1)体外成骨活性研究方法分成4组,AdvhBMP2转染细胞 HA组、AdvhBMP2转染细胞组、未转染细胞 HA组和未转染细胞组,采用免疫沉淀法(IP)、Western印迹法检测hBMP2表达、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测骨涎蛋白mRNA表达、ALP和vonKossa染色及ALP定量检测;(2)裸鼠肌内诱导成骨实验裸鼠12只(共24侧)分4组注射AdvhBMP2转染细胞 HA组(n=8)、注射AdvhBMP2转染细胞组(n=8)、注射未转染细胞组(n=4)和单纯注射HA组(n=4),观察方法采用X线、成骨计量对照、组织学观察法。结果(1)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组BMSCs表达hBMP2和骨涎蛋白mRNA,两组的ALP活性均高于未转染细胞 HA组和未转染细胞组(P<0.01),并有明显的钙结节形成;(2)AdvhBMP2转染细胞 HA组和AdvhBMP2转染细胞组均有成骨,两组差异有显著性(P<0.01),未转染细胞和单纯注射HA组均未见成骨,局部以纤维和脂肪组织为主。结论HA复合AdvhBMP2基因转染的BMSCs在体外有较好的诱导成骨活性,在裸鼠肌内有良好的诱导成骨和成软骨的作用,是可注射性的骨缺损修复方法。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

骨形态发生蛋白2基因转染的兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-聚己内酯支架体外构建载基因仿生骨的实验研究

[目的] 构建聚乳酸-聚己内酯(PLA/PCL)吸附骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的聚乙二醇(PEG)纳米复合物形成生物可降解仿生骨材料,接种兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mes-enchymal stem cells,rBMSCs),检测BMP-2基因的转染情况及其对细胞增殖、分化的影响.[方法] 通过溶液共混法制备PLA/PCL载基因仿生骨,接种rBMSCs细胞于仿生骨之上,培养48 h;Real-time PCR检测转染后细胞BMP-2及骨钙素mRNA表达水平;应用Western Blot及免疫组化检测rBMSCs转染后BMP-2蛋白表达;免疫荧光检测rBMSCs细胞Ⅰ型胶原蛋白表达;ELISA检测转染后细胞培养上清中分泌BMP-2浓度,同时检测细胞内碱性磷酸酶活性,从而分析细胞分化情况;流式细胞检测转染BMP-2后细胞周期的变化.[结果] 以未转染细胞作为对照,免疫组化表明转染后细胞内BMP-2表达量明显上调(P＜0.05);Real-time PCR检测结果表明BMP-2与骨钙素mR-NA表达显著增加(P＜0.05);同时Western Blot结果同免疫组化结果相似,BMP-2也有明显上调(P＜0.01);免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达量显著上升(P＜0.01);ELISA检测细胞培养上清中BMP-2分泌量也有增加(P＜0.05);碱性磷酸酶较对照组相比活性显著增强(P＜0.05),而流式细胞检测S期细胞无明显变化(P＞0.05).[结论] 载基因仿生骨具有稳定而安全的转染性能,其转染后对rBMSCs细胞的分化效果是明显的,而对于细胞周期变化的影响并不显著.     

基因强化组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的实验研究

目的评价骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的效果。方法分离培养兔骨髓基质干细胞，经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因强化的组织工程骨（GEB）。建立兔双侧桡骨缺损（2．5cm长）模型，采用5种方法修复。A：GEB加带血管蒂骨膜移植；B：GEB加血管束植入；C：GEB加游离骨膜移植；D：GEB；E：单纯支架。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况。结果A组血运建立最快，B组血管束早期即发出分支向移植骨内长入，C组4周时游离骨膜成活并发出微小血管，D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组，12周时骨缺损部分修复，但中央区成骨不良，而E组12周时形成骨不连，缺损区内被纤维组织填充。在细胞成活率、生物力学性能、VEGF表达水平等方面，均表现为A〉B〉C〉D〉E，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BMP-2基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损，既提供了血运，又提供了有效的成骨诱导因子，是治疗长段骨缺损较为理想的方法。其中，带血管蒂骨膜联合移植修复效果最佳；血管束植入法血供重建较快，方便临床应用。     

hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合n-HA/PA66组织工程骨构建及检测

[目的]探讨腺病毒介导共表达人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelia growth factor 165,VEGF165)载体转染兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)体外构建组织工程骨的可行性。[方法]采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定;第3代BMSCs作为细胞实验对象,实验共分2组:Ad-BMP2-VEGF165为实验组和Ad-GFP为对照组;首先用不同感染复数感染BMSCs,并进行ELISA和Western blot检测细胞h BMP2和h VEGF165的表达;其次将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,7 d后扫描电镜观察细胞贴附、生长状况;同时,7 d后消化收集贴附n-HA/PA66上的细胞,Western blot检测贴附生物材料细胞中骨钙素(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,以及3 d和7 d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%);腺病毒感染后h BMP2和h VEGF165蛋白水平高表达;扫描电镜见感染细胞分布均匀,生长状态良好。实验组与对照组相比,复合n-HA/PA66后Western Blot检测显示OC和OPN表达和ALP活性均较高,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒感染BMSCs后目的蛋白较高量表达,同时感染后BMSCs可以在n-HA/PA66进行良好的黏附、生长、增殖、矿化,Ad-BMP2-VEGF165双基因表达组织工程骨构建成功。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的：采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7（hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSc ),检测外源基因的表达。方法：常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果：原位杂交和组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论：采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

骨髓基质干细胞及其在骨组织工程中的应用

骨髓基质干细胞（BMSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干细胞,具有较强的自我更新能力和多向分化潜能,在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞等多种细胞.BMSCs的应用是目前国际上骨组织工程领域的重要研究内容,具有广泛的临床应用前景.近年来,许多实验室从分子、生化、物理等水平对其成骨分化调控进行了深入研究,取得了较大的进展.     

骨髓基质干细胞复合改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯体外构建组织工程化软骨

目的 探讨应用骨髓基质干细胞(BMSCs)复合光接枝改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯(PHBV)构建组织工程化软骨的可行性. 方法 将3代绵羊骨髓基质细胞接种于光接枝改性的三维PHBV支架材料上,24 h后以成软骨诱导液培养,3周后,复合培养物行扫描电镜观察,组织学观察,测定糖胺聚糖(GAG)含量.并将复合物埋植于绵羊腹部皮下,4周后取出,行大体及组织学观察. 结果 经成软骨诱导后,扫描电镜下,BMSCs的突触逐渐变短,由长梭形向扁平形转变,分泌基质量亦明显增多.组织学观察见细胞支架复合物阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性.GAG含量测定示诱导3周后,细胞分泌的GAG量(1306.7±192.3)明显高于未经诱导的BMSCs(205.0±26.2)(P<0.001),但仍低于正常软骨细胞(1969.2±235.3)(P<0.001).复合物埋植于皮下4周后,其内炎症细胞浸润明显,但番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性. 结论 以BMSCs为种子细胞,复合改性的PHBV,可于体外构建出软骨样组织,但该组织的理化特点与正常软骨仍有差距.     

人骨髓基质干细胞体外诱导培养的新方法研究

目的为骨组织工程的临床应用提供一种新的人骨髓基质干细胞(BMSCs)培养方法,以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入。方法采用10%富血小板血浆(PRP)替代动物血清配比高糖DMEM培养基,体外诱导培养(50μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)人BMSCs,快速扩增后,倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及细胞增殖情况。ALP染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果人BMSCs24h开始贴壁,7d左右细胞融合。诱导培养后细胞能较快地扩增;ALP染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。结论以自体PRP替代动物血清体外诱导培养人BMSCs是一种良好的培养方法,所培养的细胞数量及其生物学特性能快速达到临床应用的需求。     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响,从而为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。方法全骨髓法培养兔BMSCs,按感染复数(MOI)值不同设定为四组,分别转染兔BMSCs,观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值,进行后续实验。转染兔BMSCs,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV对细胞增殖活性的影响。以重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(AAV-EGFP)为参照,行流式细胞仪检测,计算转染效率。AAV-hBMP4与对照病毒AAV-EGFP分别转染细胞,观察细胞形态,行碱性磷酸酶(ALP)染色、Von Kossa染色及ALP含量测定,观察成骨活性。兔肌袋实验观察异位成骨情况。结果MOI值为5×10~4 vg/cell时,AAV对细胞形态影响最小,以此值进行后续实验。AAV转染后,细胞增殖活性良好,转染效率为55％～65％。AAV-hBMP4转染后,细胞形态呈现典型的成骨改变,ALP染色及Von Kossa染色均出现成骨的特征性改变,而AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定显示,实验组ALP含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=218．65,P＜0．01)。兔肌袋实验术后4周组织学检测可见大量钙盐沉积,矿化结节形成。结论AAV-hBMP4转染效率高,对BMSCs的增殖活性影响小,AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨的理想种子细胞。     

骨髓间充质干细胞在丝素蛋白/骨形态发生蛋白中的生物学行为观察

目的 观察丝素蛋白与牛骨形态发生蛋白的载体系统与骨髓间充质干细胞的体外相容性.方法 将多孔丝素蛋白修剪成20×10×5 mm长方体状物,置入6孔板中;将粉状bBMP用PBS液溶解制成2mg/ml混悬液,0.5ml无菌移液管滴定于多孔丝素蛋白上(0.5毫升/个).骨髓间充质干细胞以107/ml接种到载体系统上,复合4小时后加入生长液继续体外培养,每1、4、8天时进行碱性磷酸酶、矿化结节染色观察以及扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察;另外同时设立单纯丝素蛋白与细胞复合培养对照组进行观察.结果 倒置显微镜、扫描电镜和共聚焦显微镜下观察到细胞在两种材料上生长形态、活性正常,体外培养24小时时细胞已贴附材料上,呈匍匐状伸展,以后逐渐融合生长,8天时大量细胞成片状攀附在材料表面,并分泌有大量的网状细胞外基质,实验组可见结节状基质生成;碱性磷酸酶、矿化结节染色观察发现实验组细胞碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性反应,对照组阴性.结论 丝素蛋白是一种良好细胞外基质材料,也是一种良好生长因子的缓释载体.