糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

同种异体胰岛细胞移植在糖尿病小鼠中的实验研究

目的 通过建立糖尿病小鼠模型,观察同种小鼠胰岛细胞移植前后血糖、胰岛功能的变化,探索胰岛细胞分离、纯化、移植的方法及有效性.方法 采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制糖尿病小鼠模型,经胆囊注入V型胶原酶水浴消化胰腺并进行密度梯度离心以分离纯化胰岛细胞,并在消化液和Ficoll分离液中加入了大豆胰酶抑制剂(STI)和牛血清白蛋白组份V(BSA),用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,锥虫蓝排斥试验评估胰岛存活率;糖尿病小鼠行同种异体胰岛细胞移植后,检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,以判定胰岛功能.结果 糖尿病小鼠模型胰腺形态有明显病理变化,同种小鼠胰岛纯化后细胞形态完好,使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的(40.7±13.2)个提高到了(263.5±32.I)个(P<0.01),活性在95%以上,胰岛移植后,实验组48 h后血糖明显下降,C肽水平上升.结论 采用加用STI、BSA小鼠胰岛细胞分离纯化方法可增加胰岛细胞产量,同种小鼠胰岛细胞移植能明显降低糖尿病小鼠血糖水平,改善胰岛功能,从而达到治疗目的 .     

不同体重供体及理化因素对小鼠胰岛分离的影响

目的：探讨提高小鼠胰岛数量和质量的可靠方法.方法：采用胆管内胶原酶灌注和Histopaque 1 077密度离心法分离纯化胰岛.分别观察供体的体重、胶原酶的浓度、消化的时间及温度对胰岛分离起的作用.在体外,ELISA检测葡萄糖刺激引起的小鼠胰岛素分泌.在体内,胰岛移植评价胰岛对糖尿病小鼠血糖的调节功能.结果：高体重供体组胰岛的收获量显著高于低体重供体组（P＜0.01）.胶原酶浓度、消化时间对胰岛收获量起重要作用.胰岛活率≥95%.体外胰岛素释放试验表明胰岛功能良好.同种异体胰岛移植的糖尿病小鼠高血糖状态得到逆转.结论：小鼠的体重、胶原酶的浓度、消化时间和温度是影响胰岛数量和功能的重要因素.     

一种简易高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的 探索一种简便高效的建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法 摘取四只BALB/c小鼠的胰腺,0.25mmPenfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病C57小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果 纯化后共得到（789.6±26.4）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（77.12±3.23）％;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍（P<0.01）。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达（16.3±2.9d）。结论 提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

新鲜与短期培养胰岛细胞移植对移植胰岛存活的影响

目的 观察新鲜和短期培养后的小鼠胰岛细胞对移植后胰岛的再血管化及功能的影响.方法 C57小鼠作为胰腺供体,胆总管灌注胶原酶P溶液消化胰腺,Ficoll 400不连续梯度纯化获得胰岛细胞.接受不同胰岛细胞肾被膜下移植的受体糖尿病C57小鼠随机分成三组(n=10):A组接受新鲜胰岛细胞移植,B、C组分别接受培养1、3d的胰岛细胞移植.术后观察血糖变化并于移植后第14天取移植胰岛,分别进行HE染色和胰岛素、CD31免疫组织化学染色,并计算微血管密度.结果 胰岛细胞移植后3d内,三组小鼠的随机血糖浓度均＜11.0 mmol/L.A组小鼠在移植后第14天时的血糖浓度仍＜11.0 mmol/L,而B、C组小鼠血糖浓度在移植3d后呈现持续上升,此后各时间点的血糖浓度均显著高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学胰岛素染色结果显示:A组小鼠肾被膜下成团的细胞被染成棕褐色,B、C组类似细胞团仅有少量着色.免疫组织化学CD31染色发现,A组小鼠肾被膜下移植细胞团内部有大量细胞胞质被染成棕黄色,而B组和C组仅有少量细胞着色;A组肾被膜下胰岛内微血管密度显著高于B、C组(P＜0.05).结论 小鼠新鲜胰岛细胞移植较短期培养后胰岛细胞移植更有利于移植胰岛的再血管化及存活.     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化方法。分离成年Wistar大鼠胰岛,葡聚糖密度梯度离心纯化。大鼠胰腺消化后,胰岛收获量为710～1015个/胰腺,纯化后胰岛收获量为610—820个/胰腺,纯度达92%。纯化胰岛形态结构完整,内分泌细胞超微结构保持良好;对葡萄糖刺激反应,胰岛素释放量是基础分泌水平的8倍;异体移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

人胰岛的分离纯化和功能评价

目的 应用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化人的胰岛,并进行功能和安全性的评价.方法 获得6例成人尸体胰腺组织供体,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化胰岛,并分析胰岛的数量、纯度和活力.采用免疫荧光法分析胰岛内分泌细胞的组成和分布;检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛移植后的动物血糖水平.并对分离胰岛的安全性指标进行评价.结果 分离纯化后的胰岛数量为(22.9±3.1)万IEQ,纯度为(59.0 ±8.9)%,活力为(89.0±3.0)%.免疫荧光显示,胰岛由4种内分泌细胞组成并呈正常分布.葡萄糖刺激胰岛素释放的刺激指数为8.1 ±4.0.胰岛移植于糖尿病裸鼠后,血糖在3 d后降至正常水平并维持超过30 d.分离胰岛样本的各项安全性指标在规定范围之内.结论 采用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化的胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性方面都达到临床胰岛移植的标准,为开展临床胰岛移植奠定了基础.     

一种简易高效建立小鼠胰岛移植模型的方法

目的探索一种简便高效建立小鼠胰岛移植模型的方法。方法摘取4只C57BL/6小鼠的胰腺,0.25 mm penfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20 min;采用自制的推进式离心管,以单一密度梯度Ficoll液(1.088 g/ml)纯化胰腺消化物,双硫腙对胰岛进行特异性染色,利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能;纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病BALB/c小鼠的肾包囊下,术后观察其血糖变化。结果纯化后共得到(789.6±26.4)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(77.12±3.23)%;胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的2.35倍(P<0.01)。移植后可逆转糖尿病小鼠的高血糖平均达(16.3±2.9)d。结论提供了快速获取小鼠胰岛细胞的方法,为胰岛移植的实验研究建立了一种简易高效的制作动物模型的方法。     

FK506对糖尿病小鼠胰岛移植物功能及再血管化的影响

目的探讨小鼠胰岛移植术后服用他克莫司（FK506）对胰岛移植物生物学功能及再血管化的影响。方法小鼠胰腺经胶原酶P灌注消化后,Ficoll．400不连续密度梯度离心提纯并培养制备供体胰岛。1型糖尿病受体小鼠接受肾被膜下胰岛移植并分成两组：单纯同系基因胰岛移植组（PIT组）和同系基因胰岛移植后加用FK506组（PIT＋FK506组）。监测受体小鼠血糖浓度的变化,观察移植物组织学形态、胰岛素分泌功能及新生血管生成情况。结果两组小鼠各时间点血糖浓度的变化差异无统计学意义（P〉0．05）。组织形态学观察发现两组小鼠胰岛移植物均存活良好,无明显差别。移植后第3～5天和第20天,PIT＋FK506组移植物血管内皮生长因子（VEGF）和CD34表达均较PIT组有所降低;PIT组肾被膜下移植物微血管密度分别为16．6±1．3和96．7±2．3,PIT＋FK506组分别为9．3±1．0和61．0±2．7,相同时间点两组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论治疗剂量的FK506可在一定程度上抑制胰岛移植物的再血管化,但不会直接影响胰岛细胞的生物学功能。     

Apelin对肥胖糖尿病大鼠胰岛功能的影响

目的：研究孤独G蛋白偶联受体配体（Apelin）对肥胖糖尿病大鼠胰岛功能的影响。方法：健康8周龄的SD雄性大鼠70只,随机取其中20只予普通饲料喂养,50只给予高脂饲料喂养。喂养12周,制造肥胖大鼠模型。肥胖大鼠成模后,随机取肥胖大鼠30只,予左下腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）溶液（45mg/kg）,制造糖尿病大鼠模型,注射后第4天采用罗氏血糖仪采尾血,测定血糖〉16.67 mmol/L表示已成模。然后进行静脉注射葡萄糖耐量—胰岛素释放试验：实验组1注射葡萄糖（1g/kg）加Apelin-36（200nmol/kg）,实验组2仅注射葡萄糖（1g/kg）,在注射0,5,10,30,60min各点抽取大鼠静脉血0.5mL,测定胰岛素水平。并计算各组的胰岛素曲线下面积（IAUC）。结果：1肥胖糖尿病组大鼠的血浆胰岛素水平高于正常对照组（P〈0.01）,肥胖组大鼠的血浆胰岛素水平高于肥胖糖尿病组（P〈0.01）;2正常对照组、肥胖组和肥胖糖尿病组大鼠经同时注射Apelin-36和葡萄糖后,胰岛素曲线下面积均下降,下降幅度分别为40.0%,52.3%和38.1%。结论：Apelin可以减少肥胖糖尿病大鼠葡萄糖刺激的胰岛素释放,降低肥胖糖尿病大鼠的胰岛功能。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞（BMSC）移植对糖尿病大鼠的作用。方法：通过贴壁法分离培养同种异体SD大鼠的BMSC,应用重组腺病毒-绿色荧光蛋白（Ad-GFP）病毒感染传2代的BMSC,并经筛选获得稳定表达GFP的BMSC用于移植。将链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠（血糖≥16．7mmol/L）随机分为实验对照组[（22．27±2．23）mmol／L,n=6）和移植组[（2218±194）mmol／L,n=9）]。移植组大鼠尾静脉注射BMSC悬液04ml,细胞数lxlO^6xlO^7／ml;在实验对照组及造模前随机抽取的5只正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水。移植2周后采血测各组血糖、糖化血红蛋白（HbAc）、胰岛素,并处死大鼠剖取胰腺,制作石蜡切片进行胰岛素免疫组化及冰冻切片荧光倒置显微镜直接观察GFP表达。结果：实验2周,实验对照组糖尿病大鼠血糖[（27．96±1．87）mmol／L,n=6）]、HbAlc（22．51±2．99,n=6）明显高于正常对照组[（7．97±1.00）mmol／L;（9．15±0．82,n=5）],胰岛素[（11．57±3．25）mU／L,n=6）]明显低于正常对照组[（33．68±6．21）mUL,n=5）]（P〈0．001）。移植组血糖[（23．63±6．42）mmol／L,n=9）]、HbA1c（18．26±3．96,n=9）低于实验对照组（尸〈O．05）,胰岛素[（13．89±7．89）mU／L,n=9）1高于实验对照组（尸〉0．05）。免疫组化结果显示,实验对照组胰岛及胰岛中心细胞数明显减少。胰岛素反应基本阴性。仅见个别胰岛细胞内出现少量微弱淡黄色的细颗粒。移植组大鼠胰岛中心部细胞增多,大部分胰岛素反应阳性或强阳性呈黄色或褐色颗粒。胰腺外分泌组织可见表达EGFP的细胞,胰岛中未发现其表达。结论：糖尿病大鼠经同种异体BMSC移植后,血糖、HbA,c均下降,胰岛素水平升高,可能通过内源性胰岛细胞增生发挥治疗作用。     

不同途径骨髓基质干细胞移植治疗小鼠糖尿病效果

目的研究不同途径骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对小鼠糖尿病治疗效果。方法分离骨髓,贴壁培养并纯化和扩增BMSCs。腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病动物模型。取2×105个第3代BMSCs,对模型鼠分别进行胰腺内多点注射、尾静脉移植以及肾被膜移植。动态观察移植后小鼠的血糖、体质量及行为的变化。结果与糖尿病对照组相比,胰腺移植组、尾静脉移植组和肾被膜移植组小鼠的糖尿病症状有所改善,血糖明显降低(F=32.58~48.35,q=10.06~14.98,P<0.05),以胰腺移植组血糖下降更为显著。结论 3种途径BMSCs移植对小鼠糖尿病均有治疗作用。     

东方田鼠三个脂肪肝相关基因的克隆及分析

目的以C57BL／KsJ—db／＋表型正常小鼠为对照组,研究自发性Ⅱ型糖尿病动物C57BL／KsJ—db／db小鼠的体生长曲线、糖代谢曲线、血清胰岛素水平变化、主要脏器重量、脏器系数等部分生物学特性,并探讨其肝脏、肾脏和胰腺等组织病理学变化。方法实验为期20周,从第4周开始,每周测定db／db以及db／＋小鼠体重、血糖,每2周测定血清胰岛素水平,20周龄处死,脏器、脂肪称重,部分组织用10％中性甲醛固定,制作病理切片。结果①db／db小鼠体重、血糖和血清胰岛素水平比同龄对照组高（P〈0．01）;②db／db小鼠各脂肪系数明显大于db／＋小鼠（P〈0．01）,而脾脏、胰腺以及肾脏则相对萎缩,特别是脾脏和雌性小鼠的胰腺与对照组相比差异极显著（P〈0．01）;③db／db小鼠肝细胞大片坏死、脂肪变性、炎细胞浸润、纤维组织增生;肾问质组织充血、水肿,肾小管内见蛋白管型、上皮细胞脂肪变性;胰岛数量明显减少、体积缩小,岛内细胞数量也相对减少。结论db／db小鼠是一种肥胖的,伴有高血糖、高度胰岛素抵抗,肝脏、肾脏病变和胰岛功能不足的适用性Ⅱ型糖尿病动物模型。     

游离脂肪酸对大鼠胰岛分泌功能和胰岛细胞凋亡的影响研究

目的：研究游离脂肪酸对体外培养SD大鼠胰岛功能和胰岛细胞凋亡的影响并探讨可能机制。方法：取健康雄性SD大鼠胰岛原代分离培养,分为6组,培养1d：NC1组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA1组（0．25mmol／L）、FFA2组（0．5mmol／L）;培养3d：NC2组（5．6mmol／L葡萄糖）、FFA3组（0．25mmol／L）、FFA4组（0．5mmol／L）;每组6个样本,每个样本20个胰岛。采用RT—PCR扩增胰岛素、PDX-1、Bax、Caspase-3基因mRNA表达,TUNEL法检测胰岛细胞凋亡率,放射免疫法检测胰岛素水平。结果：①FFA1、FFA2组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC1组明显下降,FFA1、FFA2组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC1组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）;②FFA3、FFA4组Insulin、PDX-1基因表达量、胰岛素分泌较NC2组明显下降,FFA3、FFA4组凋亡基因Bax、Caspase-3表达量及胰岛细胞凋亡率较NC2组明显升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：游离脂肪酸抑制体外培养SD大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能,其可能机制是FFA抑制胰岛素基因、PDX-1基因的合成,刺激胰岛细胞凋亡基因Bax、Caspase-3表达,并导致胰岛细胞凋亡,最终导致胰岛细胞分泌功能下降。     

厄贝沙坦对2型糖尿病SD大鼠胰岛结构和功能的影响

目的：观察厄贝沙坦干预对2型糖尿病（T2DM）大鼠胰岛结构和功能的影响,以探讨其保护胰岛结构和功能的可能机制.方法：40只SD大鼠随机分为4组,每组10只,即A组（普通饲料组）,B组（高糖高脂饲料组）,C组（T2DM对照组）、D组（厄贝沙坦干预组）.观察厄贝沙坦干预对T2DM大鼠血糖、胰岛素等胰岛结构和功能的影响.结果：D组与C组比较,空腹血糖下降25.08％,稳态模型评价胰岛素抵抗指数下降30.87％,ISI提高了11.93％,明显改善糖耐量.D组与C组大鼠比较,胰岛内β细胞相对量增加67.35％,胰岛β细胞内胰岛素水平增加43.86％,胰岛β细胞胰岛素mRNA表达水平增高9.79％.结论：厄贝沙坦干预可降低T2DM大鼠空腹血糖、HOMA-IR,提高ISI,改善胰岛结构和功能.     

丝胶对2型糖尿病大鼠糖脂代谢及胰岛形态结构的影响

目的：探讨丝胶对2型糖尿病大鼠糖脂代谢和胰岛形态结构的影响。方法：雄性SD大鼠48只随机分为正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和二甲双胍组,每组12只。腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型;待成模后,二甲双胍组、丝胶治疗组大鼠分别给予二甲双胍（55．33mg／kg／d）和丝胶（2．4g／kg／d）灌胃35d。检测各组大鼠的血糖和血脂,HE染色观察胰岛的形态结构。结果：与模型组大鼠相比,丝胶治疗组、二甲双胍组大鼠的血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、游离脂肪酸明显降低,高密度脂蛋白明显升高,差异具有统计学意义（P〈0．01）。模型组大鼠胰岛分布稀疏且不均匀,轮廓欠圆润,边缘不规则,胰岛细胞数量减少;丝胶治疗组和二甲双胍组大鼠胰岛的形态结构明显改善。结论：丝胶可明显改善糖尿病大鼠的糖脂代谢和胰岛的形态结构。