检测破伤风类毒素的酶联免疫吸附法的建立及应用

目的  建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）的方法。方法  TT免疫家兔以制备高效价血清抗TT抗体。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗TT多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA法。结果  建立的ELISA法与丝状血凝素、百日咳毒素及白喉类毒素无交叉反应,特异性较好。该ELISA法在0.5~16.00 Lf/L TT测量区间有最佳线性,决定系数＞0.99。实验内和实验间检测14.0、12.0、6.0、3.0和1.5 Lf/L TT,变异系数为4.7%~9.8%,回收率为92.7%~109.0%,精密度和准确度均符合常规质控要求。该法的定量下限为1.5 Lf/L TT。结论  建立的ELISA法可有效检测破伤风疫苗纯化过程中的TT含量,为破伤风疫苗质量控制奠定了基础。     

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的  建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussis toxin, PT）含量的测定方法。方法  免疫家兔制备高效价抗PT血清,纯化抗PT多克隆抗体并进行酶标记,建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果  建立的方法在0~20 ng/ml PT测量区间呈现最佳线性,相关系数＞0.99,且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素,结果均为阴性,说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验间3次测定16.0、8.0、4.0、3.0 ng/ml PT,变异系数为2.8%~9.7%,回收率为95.7%~106.0%,精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求,定量限度为3.0 ng/ml。结论  该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的PT,为PT质量控制奠定了重要基础。     

抗百日咳毒素单克隆抗体的纯化及应用研究

目的纯化抗百日咳毒素(PT)的单克隆抗体(M cAb),并建立特异、准确的PT定量检测方法。方法采用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法纯化杂交瘤细胞腹水,并经阻断抑制试验筛选识别不同表位的M cAb,用于建立定量检测PT的ELISA方法。结果经SDS-PAGE分析,纯化M cAb的纯度均在90%以上,选择二株识别不同抗原位点M cAbs,应用于检测PT的双抗夹心ELISA方法,灵敏度为2.14μg/L,批内变异系数5.85%,批间变异系数9.27%,平均回收率为108.12%,应用该法测定了国内几大生产厂家送检的无细胞百日咳疫苗原液中PT含量。结论获得了纯度高的抗PT M cAb,建立了一种特异、准确的定量检测PT的ELISA方法,并用于无细胞百日咳疫苗原液中PT含量的检测,为无细胞百日咳疫苗的质量控制提供了有力的手段。     

检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒的建立及应用研究

目的  建立特异、敏感的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒。方法  采用大肠杆菌菌体蛋白免疫家兔,制备得到高效价抗菌体蛋白抗血清。将经饱和硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和亲和层析纯化的兔抗大肠杆菌菌体蛋白特异性多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体,用生物素标记检测抗体,并加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素。结果　建立的大肠杆菌菌体蛋白夹心ELISA检测方法的敏感性为0.32 μg/L,检测范围为1~100 μg/L,与国际同类商品化试剂盒相当。此法具有良好的稳定性,其批内变异系数小于7.7%,批间变异系数小于6.2%。结论  建立了特异、敏感、稳定的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒,为生物制品中残留大肠杆菌菌体蛋白的质量控制提供了一种重要的检测方法。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14，PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清，得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体，兔抗PS14多抗为检测抗体，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗，PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度，建立标准曲线，并验证该方法的准确性、精密度和特异性，考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml，兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml，标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml，线性良好，相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%，多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%；含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法，该方法准确性、精密度、特异性良好，且检测结果不受佐剂的影响，具有一定耐用性。     

疫苗中残留卵清蛋白ELISA定量测定方法的建立

目的 建立ELISA法检测疫苗中残留卵清蛋白的含量.   方法 将进口纯化兔抗卵清蛋白抗体作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记兔抗卵清蛋白抗体作为酶标抗体,以系列含量的卵清蛋白溶液为标准,采用ELISA双抗体夹心法,对供试品中残留卵清蛋白进行定量测定.   结果 最佳线性范围为1.25～20 ng/ml,相关系数r≥0.99;定量限度为1.25 ng/ml;准确性试验回收率为89.2%～103.6%;精密性试验内和试验间变异系数分别为5.6%～6.7%和4.2%～9.4%.与马血清、羊血清、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、流行性感冒病毒裂解疫苗基质液及其他无残留卵清蛋白的疫苗均无交叉反应.   结论 本方法特异性强、灵敏度高,准确性、重复性和稳定性好,可用于疫苗中残留卵清蛋白的定量检测.     

原代地鼠肾细胞疫苗中残余宿主细胞蛋白检测方法的建立及初步验证

目的 建立定量检测原代地鼠肾细胞(primary hamster kidney cell,PHKC)疫苗中残余宿主细胞蛋白含量的方法 .方法 制备PHKC蛋白免疫家兔,对获得的抗血清进行纯化并标记辣根过氧化物酶,通过优化各反应条件建立ELISA方法 ,同时进行方法学验证.结果 ELISA检测方法的最佳包被抗体质量浓度为6 mg/L,酶标抗体工作浓度为1:2000,最佳检测区间为12.500～200.000μg/L,定量限度为23.250μg/L,准确度和精密度较佳.结论 建立了一种简单、准确、可靠检测PHKC病毒性疫苗中宿主细胞蛋白残留量的ELISA双抗体夹心法.     

检测黑猩猩腺病毒68型抗原的双抗体夹心ELISA的建立

目的  建立定量黑猩猩腺病毒68型（chimpanzee adenovirus type 68，AdC68）含量的双抗体夹心ELISA，并验证其可行性。方法  用表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的非复制型AdC68（AdC68GFP）感染HEK293细胞，收获病变细胞并进行超速离心纯化AdC68GFP。用纯化AdC68GFP免疫家兔制备抗AdC68GFP抗体。以抗AdC68GFP抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗腺病毒HEXON IgG为酶标抗体，建立双抗体夹心ELISA，确定该法的线性范围，并验证该法的准确度、精密度、专属性和适用性。结果  纯化AdC68GFP的蛋白浓度为38.8 µg/ml，其中HEK293细胞的蛋白浓度低于0.3 µg/ml。双抗体夹心ELISA的最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为1∶50和1∶500。该法的线性范围为0.06~3.88 µg/ml，线性相关系数为0.999 6。高、低浓度AdC68GFP样品的回收率分别为93.17%和94.33%，变异系数分别为6.72%和3.44%。该法可特异性检测AdC68GFP抗原，未发现与HEK293细胞蛋白发生交叉反应。应用该法检测AdC68GFP纯化过程中的样品可反映病毒的纯化效果。结论  建立的双抗体夹心ELISA具有良好的准确度、精密度和特异性，可用于AdC68纯化工艺过程中对病毒蛋白含量的快速检测。     

检测百日咳抗原的系列酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在百日咳疫苗生产中的应用

 目的   评估检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)和黏着素(pertactin,Prn)的3种酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,aPV）生产质量控制中的应用。 方法   对3种酶免疫测定试剂盒进行热加速试验（37 ℃放置3 d）和长期稳定性试验（4 ℃放置6月）,根据试剂盒的标准曲线相关系数、最高浓度标准品与阴性对照的吸光度值之比（P/N）值、质控品回收率评估试剂盒的稳定性。将3种试剂盒用于aPV生产的发酵、纯化、吸附阶段的PT、FHA、Prn定量检测,以确定3种试剂盒对aPV生产质量控制的可行性。 结果   3种酶免疫测定试剂盒的37 ℃热加速试验和4 ℃长期稳定性试验的各项质量参数均符合相关要求。采用试剂盒定量各生产阶段的百日咳抗原含量显示：百日咳杆菌的发酵终点在第42~46 h;各3批PT、FHA和Prn组分液的纯化回收率分别为49.24%、56.12%和63.65%、68.75%、55.60%和49.76%、75.73%、60.63%和50.10%。采用单独吸附的铝佐剂抗原吸附率高于采用混合吸附,但单独和混合吸附方式制备的疫苗的效力无差异。 结论   检测PT、FHA和Prn的3种酶免疫测定试剂盒具有良好的稳定性,可用于aPV生产的质量控制。     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。     

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗(groups A,C,Y,W135 meningococcal polysaccharide vaccine,MPV4)C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法.  方法 制备抗C群多糖多克隆抗体,所得的多克隆抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶.分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对C群多糖进行特异性定量测定.  结果 建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好,未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应.C群多糖在2.5～20.0 ng/ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.99.该法的准确度和精密度均较好,试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0.6％ ～9.1％和87.5％ ～ 100.0％,定量限度为4.0 ng/ml.采用该法测定3批MPV4显示,C群多糖含量及多糖分子大小KD值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致,均符合暂行质量标准.  结论 建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4 C群多糖的关键质量指标测定.     

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用

目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗(HPV16 L2E6E7)酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性(R2>0.99)和回收率(90%~110%);特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。     

b型流感嗜血杆菌多糖竞争ELISA检测方法的建立与应用

 目的   建立检测b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多聚核糖基核糖醇磷酸盐(polyribosylribitol phosphate,PRP)的竞争酶联免疫吸附法(competative enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA).   方法 以Hib PRP-酪胺(PRP-Ty)为包被抗原,待测PRP为竞争抗原,利用方阵滴定法确定抗原与血清抗PRP抗体的最适反应条件,建立cELISA法并验证其准确性和精密度,并将该法与传统检测法进行比较.   结果 最适包被PRP-Ty浓度为1.30 mg/L,血清抗PRP抗体稀释度为1∶40 000.该法的检测线性范围为6.25～100.00 mg/L,决定系数(R2)为0.99,批内精密度为3.39％～6.53％,批间精密度为8.48％.该法对Hib PRP的检测结果与传统化学法一致.  结论 建立的Hib多糖cELISA法的准确性和精密性良好,可特异性检测Hib PRP.     

Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用

目的  建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV）D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价。方法  以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水。牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体（多抗）和小鼠单抗。以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA。对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证。结果  纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80%和90%以上。经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000、1:10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1:10 000、1:20 000、1:10 000。建立的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4~13.0、0.4~12.0和0.4~20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99。该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应。用该法对高、中、低浓度样品进行测定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值（×100%）分别为97%～111%、91%～104%和95%～102%、相对标准偏差分别为≤7%、≤9%和≤10%;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势。结论  建立了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价。     

抗汉城病毒荧光单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗汉城病毒（Seoul virus,SEOV）荧光单克隆抗体（单抗）,并初步应用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液的病毒灭活验证。 方法  以SEOV L-99株灭活病毒原液为免疫原,采用小鼠杂交瘤细胞融合技术,筛选抗SEOV特异性单抗杂交瘤;小鼠体内诱生法制备单抗腹水,蛋白A亲和层析纯化单抗,并以蛋白质印迹法鉴定其特异性;间接ELISA测定单抗效价和相对亲和力;纯化单抗采用搅拌法标记异硫氰酸荧光素,并分别采用直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法对Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行病毒灭活验证。结果 共筛选出4株特异性抗SEOV L-99株杂交瘤1D5、2E3、3A4及5B7。蛋白质印迹法鉴定4株单抗均与SEOV L-99株核衣壳蛋白发生特异性反应;间接ELISA测定腹水效价为3.13×10^-8~ 1.25×10^-7;相对亲和力顺序为1D5>3A4>2E3>5B7;纯化抗体纯度>95%;异硫氰酸荧光素标记1D5株单抗的结合比率为3.4;直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法检测盲传3代的Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液,病毒灭活验证结果一致。结论 成功筛选到高效价特异性抗SEOV单抗,并制备成荧光单抗,可用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗生产工艺中的病毒灭活验证。