一株鹅H5N1亚型流感病毒基因特性的分析

目的 弄清了Ａ／鹅／广东／２／９６（Ｈ５Ｎ１）毒株对鹅致病的分子生物学基础 ，研究香港区人群中发生的禽（Ｈ５Ｎ１）流感的病因，方法 病毒ＲＮＡ经逆转录合成ｃＤＮＡ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，产物纯化，采用双脱链末端终止法测定核苷酸序列，结果 Ａ／鹅／广东／２／９６（Ｈ５Ｎ１）与Ａ／ＨＫ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）毒株ＲＮＡ４核苷酸序列有２２个位点不同（同源性为９８．８％）无任何掉失或插入。它与人和     

H5N1禽流感病毒headless HA基因在杆状病毒中的表达

目的 建立能有效表达禽流感病毒A/Hubei/1/2010( H5N1)无头HA( headless HA)的杆状病毒系统.方法 利用RT-PCR扩增获得headless HA基因,克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,命名为pFastBac1headless HA.将pFastBac1headless HA转化到DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒Headless HA-Bac.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,并进行Western Blot和红细胞凝集试验检测.结果 Headless HA在Sf9细胞中能有效表达,不能使红细胞发生凝集.结论 本研究为利用headless HA表达蛋白研制广谱流感疫苗奠定了基础.     

对流感病毒神经氨酸酶N1亚型抗体筛选体系的评价

目的 比较真核表达、活病毒感染、酵母展示系统用于流感病毒神经氨酸酶(NA) N1亚型抗体筛选的差别,寻找合适的抗体筛选系统.方法 将pVRC-VN NA-HAtag质粒转染入293T,通过酵母展示获得重组NA.通过反向遗传学获得重组病毒A/Sichuan/1/2009.用荧光发光法检测NA性能,用流式细胞仪检测NA与5种候选抗体结合情况.结果 真核表达、酵母展示系统均可以使NA在表面展示,且具有与活病毒NA相似的特性.在候选的5种抗体中,真核表达以及病毒的NA可与抗体1、5结合,病毒的NA还能与抗体4结合;而酵母展示系统的NA与5种抗体均不能结合.结论 真核表达、真病毒感染系统适合NA抗体的筛选,酵母展示系统表达的NA其表面抗体识别的表位有差异.     

含有H5N1 NA基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的免疫效果研究

目的 考察含有禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)优化型NA基因的重组腺病毒在BALB/c小鼠体内的免疫效果,并筛选合适的免疫剂量.方法 重组病毒以肌内注射方式在第0周和第4周免疫BALB/c小鼠两次,低、中、高组的免疫剂量分别是10~5、10~7和10~9 TCID_(50)/次,第5周时分别使用神经氨酸酶活性抑制试验和EHSpot实验来检测和比较疫苗的体液和细胞免疫效果.结果 重组病毒免疫后的小鼠均可检测出针对NA抗原的特异性体液和细胞免疫反应,并且免疫效果与免疫剂量呈正相关,10~7 TCID_(50)/只/次是合适的免疫剂量.另外,从包含NA全长氨基酸残基的合成肽库中筛选到两个能够刺激BALB/c小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位,即NA_(109-124):CRTFFLTQGALLNDKH和NA_(182-199):AVAVLKYNGIITIKSW.结论 含有优化型NA基因的重组腺病毒疫苗能够诱导BALB/c小鼠同时产生NA抗原特异性的体液和细胞免疫反应,是较好的H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究.     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

H1N2新亚型流感病毒神经氨酸酶基因来源的进一步研究

对流感病毒Ｈ１Ｎ２亚型重组株Ａ／哈防／１／８８、Ａ／哈防／１２／９２以及Ｈ３Ｎ２亚型病毒株Ａ／雅防／２／８７、Ａ／京防／５７／８９８和Ａ／粤防／１／９２神经氨酸酶（ＮＡ）基因核苷酸全序列的测定，进一步弄清了Ａ／哈防／１／８８病毒株的ＮＡ基因确来自当时人群中流行的Ｈ３Ｎ２亚型病毒株，很可能是来自Ａ／雅防／２／８７类病毒株；而Ａ／哈防／１２／９２病毒株的ＮＡ基因可能是与Ａ／哈防／１／８８病毒株的ＮＡ基     

甲型流感病毒（N1N2）亚型毒株血凝素和神经氨酸酶基 …

目的 研究新分离到的Ｈ１Ｎ２亚型毒株血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ）基因的来源。方法 病毒通过鸡胚增殖后提取其ＲＮＡ,通过逆转录合成ｃＤＮＡ,经ＰＣＲ扩增和产物纯化,用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定,并用ＭｅｇＡｌｉｇｎ（１．０３版）和Ｅｄｉｔｓｅｑ（３．６９版）软件进行种系发生学分析。结果 新分离到Ｈ１Ｎ２毒株ＨＡ１区氨基酸序列与Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）和Ａ／Ｇｕａｍｇｄｏｎｇ／６／９     

人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达

目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统,为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板,PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中,构建重组质粒pQE80-L/M1,转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白,能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合,且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶（NA）重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

一起新甲型H1N1流感暴发疫情的流行病学和病原学分析

目的 对2009年11月下旬北京市延庆县一封闭式管理的集体单位暴发的一起急性呼吸道感染疫情进行流行病学和病原学分析.方法 采集患者咽拭子标本,用Real-Time RT-PCR方法进行新甲型,季节性甲1、季节性甲3和乙型流感病毒的核酸检测.对ct＜30的阳性标本进行全长NA基因编码区扩增、克隆、测序及进化树分析.结果 27份标本有22份（81.48%）real-Time RTPCR为新甲型H1N1阳性;暴发株全长神经氨酸酶（NA）基因核苷酸和氨基酸序列同源99.9%和99.8%,与A/Tomsk/05/2009（H1N1）序列同源最高达100%,且NA的酶活性位点及其周围辅助位点、糖基化位点未见氨基酸替换现象.结论 此次暴发疫情主要由同一新甲型H1N1流感病毒毒株传播所致;同一病毒株在同一时期不同地域流行;高度保守的NA基因氨基酸序列是抗流感药物研发的重要靶点.     

我国猪群中H9N2亚型毒株HA和NA基因特性的研究

目的 了解我国内地从猪中分离到H9N2亚型毒株HA和NA基因来源及它们使猪致病的原因。方法 用PCR扩增目的基因，与P^GEM-T Easy Vector4℃过夜连接，重组质粒转化DH-10β细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，测序。然后，进行进化树分析。结果 两株猪H9N2毒株HA蛋白分子上第226位上氨基酸为L，这与从人和猪所分离出的H9N2毒株相同，其连接肽属对禽致病的毒株，但它们的序列为R-L-S-R，而不是R-S-S-R；其NA蛋白茎区第62～64位存在掉失，这与A／Shaoguarn/408／98，A／Swine／Hong Kong／9／98及A／Duck／Hong Kong／y280／97(H9N2)毒株相同；HA与NA基因进化树分析表明，两株猪H9N2毒株的HA基因接近于A／Chicken／Hong Kong／G23／97和A／Chicken／Hong Kong／G9／97．而NA基因接近于A／Shaoguan／408／98毒株。结论 两株猪H9N2亚型毒株的HA和NA基因可能性最大来自禽H9N2毒株。由于其HA蛋白分子上连接肽氨基酸序列发生替换，可能造成了它们对猪具有致病性。禽H9N2毒株NA蛋白茎区氨基酸掉失，造成了它们能直接感染猪。     

甲3型流感病毒M基因披甲RNA的研制

目的 研制内含甲3型流感病毒M基因RNA的披甲RNA.方法 将MS2噬菌体基因组中编码成熟酶蛋白、包膜蛋白和pac位点的DNA片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒pAR-1.将甲3型流感病毒M基因连接到pAR-1 pac位点的下游,诱导表达出内含M基因RNA的披甲RNA AR-2,并进行纯化、定量和稳定性研究.结果 成功构建和表达了耐核糖核酸酶、内含M基因RNA的披甲RNA,每1 ml LB培养基可诱导表达出约8.9×1011个拷贝的AR-2.结论 制备的AR-2稳定,无生物传染危险性,可作为甲型流感病毒M基因核酸检测的标准品和质控品.     

Immune responses to infection with H5N1 influenza virus

Influenza A H5N1 viruses remain a substantial threat to global public health. In particular, the expanding genetic diversity of H5N1 viruses and the associated risk for human adaptation underscore the importance of better understanding host immune responses that may protect against disease or infection. Although much emphasis has been placed on investigating early virus–host interactions and the induction of innate immune responses, little is known of the consequent adaptive immune response to H5N1 virus infection. In this review, we describe the H5N1 virus-specific and cross-reactive antibody and T cell responses in humans and animal models. Data from limited studies suggest that although initially robust, there is substantial waning of the serum antibody responses in survivors of H5N1 virus infection. Characterization of monoclonal antibodies generated from memory B cells of survivors of H5N1 virus infection has provided an understanding of the fine specificity of the human antibody response to H5N1 virus infection and identified strategies for immunotherapy. Human T cell responses induced by infection with seasonal influenza viruses are directed to relatively conserved internal proteins and cross-react with the H5N1 subtype. A role for T cell-based heterosubtypic immunity against H5N1 viruses is suggested in animal studies. Further studies on adaptive immune responses to H5N1 virus infection in both humans and animals are needed to inform the design of optimal immunological treatment and prevention modalities.     

两株京科猪H1N1亚型流感病毒内部基因来源的研究

目的通过内部基因研究了解两株猪(H1N1)亚型流感病毒内部基因是否含有禽流感病毒基因节段及是否与猪群中H9N2亚型毒株发生了基因重配。方法病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,通过逆转录合成cDNA,cDNA用PCR扩增。PCR产物用纯化试剂盒纯化,接着进行核苷酸序列测定,然后用MegAlign(Version1.03)和Editseq(Version3.69)软件进行基因进化树分析。结果两株京科猪H1N1病毒内部基因除PB2基因节段有所不同外,其余5个基因节段均相同,但与猪H1N1流感病毒内部基因相近,然而,与古典型猪H1N1毒株有差异。结论两株京科猪H1N1病毒不是基因重配株,它们的内部基因均属猪H1N1流感病毒基因系。     

猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究

目的 研究2002年我国内地从猪群中分离的猪型(H1N1)毒株HA和NA基因来源。及其使猪致病的原因。方法 用PCR扩增目的基因，用P^GEM-T Easy Vector，4℃过夜连接，重组质粒转入DH-10B细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，送六合通公司自动测序，并作进化树分析。结果 3株猪型(H1N1)病毒的HA和NA基因属猪型(H1N1)流感病毒，而不同于其他禽或人的H1N1亚型流感病毒。2002年猪型毒株由1991年猪型毒株演变而来。近来我国内地猪群中猪型毒株活动增强，其对猪能致病是由于病毒粒HA和NA蛋白抗原性发生变异所造成。结论 3株猪型病毒的HA和NA基因来源于猪型(H1N1)毒株。近来猪型毒株对猪具有致病性和活动增强是由于其HA和NA蛋白分子上氨基酸序列发生替换所造成。