猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用

目的　了解猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用。方法　用RT PCR扩增目的基因,用PGEM T Vector(美国Promega公司) 4℃过夜连接,重组质粒转入dH5α细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序,然后进行进化树分析。结果　两株山东猪H9N2毒株基因组与人及禽分离出的H9N2病毒均有差异,中国内地从人分离出的H9N2毒株的基因组接近鸡的毒株,而香港特区从人分离出的接近鹌鹑的毒株;禽H9N2毒株不仅宿主范围广,同时其基因组具有多样性。结论　禽H9N2亚型毒株是直接感染人,而不是通过所谓的中间宿主猪,然后再感染人。     

用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒

对患儿咽试子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感（H9N2）感染。咽试子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体，H1滴度160，母亲H9N2抗体1：20。可确定广州市有H9N2感染，并提示H9N2可通过人传播人而感染。     

两株京科猪H1N1亚型流感病毒内部基因来源的研究

目的通过内部基因研究了解两株猪(H1N1)亚型流感病毒内部基因是否含有禽流感病毒基因节段及是否与猪群中H9N2亚型毒株发生了基因重配。方法病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,通过逆转录合成cDNA,cDNA用PCR扩增。PCR产物用纯化试剂盒纯化,接着进行核苷酸序列测定,然后用MegAlign(Version1.03)和Editseq(Version3.69)软件进行基因进化树分析。结果两株京科猪H1N1病毒内部基因除PB2基因节段有所不同外,其余5个基因节段均相同,但与猪H1N1流感病毒内部基因相近,然而,与古典型猪H1N1毒株有差异。结论两株京科猪H1N1病毒不是基因重配株,它们的内部基因均属猪H1N1流感病毒基因系。     

2004-2005年中国A(H1N1)亚型流感病毒抗原性及基因特性研究

目的 阐明2004-2005年中国流行的A（H1N1）亚型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况.方法 对2004-2005年分离的A（H1N1）亚型毒株先进行单向血凝抑制试验;在此基础上选取不同时间、地点的A（H1N1）亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析.结果 单向血凝抑制实验结果表明,2004年A（H1N1）亚型病毒株对鉴定血清的血凝抑制效价与A/Shanghai/1/1999（H1N1）毒株没有4倍差异;2005年分离的A（H1H1）亚型毒株中有62株（占6.2%）病毒与A/Shanghai/1/1999（H1N1）毒株本身的血凝抑制效价相比有4倍差异.HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,我国2005年分离到的A（H1N1）亚型流感病毒株有以下位点发生变异,54 K＞R、90T＞K、101Y＞H、149R＞K、169V＞A、190D＞N、212R＞K、219K＞R、245W＞R、246Y＞F、258T＞N、318V＞A,其中54、190位氨基酸位于抗原决定簇.结论 我国2005年分离的A（H1N1）亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异.     

遗传重配获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以传统遗传重配技术选育HSN1流感病毒Veto细胞适应株,制备Vero细胞H5N1流感疫苗。方法以流感病毒Vero细胞适应株A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）为母株与反向遗传学技术改造的禽流感病毒疫苗株A／Anhui／1／2005（H5N1）共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用羊抗A／Yunnan／1／2005Va（H3N2）抗体筛选,血抑试验和基因测序鉴定病毒型别,并进行重配株的其他相关生物学试验。结果获得了1株在Vero细胞高产的H5N1流感病毒,重配前后的单价灭活疫苗免疫小鼠抗体血清效价差异无统计学意义（F=0．857,P〉0．05）。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H5N1流感病毒Vero细胞适应株。     

2004—2005年中国A(H1N亚型流感病毒抗原性及基因特性研究

目的阐明2004—2005年中国流行的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。方法对2004—2005年分离的A(H1N1)亚型毒株先进行单向血凝抑制试验;在此基础上选取不同时间、地点的A(H1N1)亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果单向血凝抑制实验结果表明,2004年A(H1N1)亚型病毒株对鉴定血清的血凝抑制效价与A/Shanghai/1/1999(H1N1)毒株没有4倍差异;2005年分离的A(H1H1)亚型毒株中有62株(占6·2%)病毒与A/Shanghai/1/1999(H1N1)毒株本身的血凝抑制效价相比有4倍差异。HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,我国2005年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,54K>R、90T>K、101Y>H、149R>K、169V>A、190D>N、212R>K、219K>R、245W>R、246Y>F、258T>N、318V>A,其中54、190位氨基酸位于抗原决定簇。结论我国2005年分离的A(H1N1)亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异。     

流感病毒感染A549细胞外泌体差异microRNA筛选及靶基因分析

目的：提取、鉴定甲型流感病毒（A/PR8/34,PR8）感染A549细胞外泌体,检测外泌体差异表达miRNA并进行靶基因预测、分析。方法：间接免疫荧光法检测PR8对A549细胞的感染率;超速离心法和免疫磁珠法提取、纯化PR8感染细胞外泌体（PR8-exos）及正常A549细胞外泌体（Con-exos）;透射电镜观察外泌体形态和粒径大小;纳米粒径分析（NTA）检测外泌体粒径分布;Western blot检测外泌体标志蛋白;RNAseq检测外泌体差异表达miRNA;KEGG和GO富集分析差异miRNA靶基因。结果：100 TCID50的PR8对A549细胞感染率为100%;透射电镜观察PR8-exos及Con-exos均为杯托状双层膜小囊泡结构;PR8-exos和Con-exos粒径大小分布几乎一致,Con-exos浓度为8.3×1010Particles/ml,PR8-exos浓度为1.6×1011Particles/ml,PR8组外泌体浓度高于对照组;PR8-exos及Con-exos均检测出CD63、CD9和Hsp70蛋白表达,而未检测到calnexin;PR8-exos和Conex...     

D-siRNAs抑制A549细胞COX-2表达

目的 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA(D-siRNAs)抑制A549细胞COX-2的表达.方法 (1)IL-1β5 g/L干预A549细胞,Western blot法观察其COX-2蛋白表达的时间依赖性.(2)Trizol法抽提A549细胞总RNA,RT-PGR扩增COX-2基因.(3)设计两端带T7 promoter,SP6 promoter的COX-2 cDNA的PCR引物,通过PCR方法,获得两端带,T7及SP6 promoter的COX-2 DNA.(4)用RiboMAX Large Scale RNA Produc-tion Systems-SP6 and T7试剂盒体外将COX-2 DNA转录为RNA.(5)长片段COX-2 RNA经Dicer酶消化为小RNA(D-siRNAs).(6)用TransMessenger Transfection Reagent将D-siRNAs转染A549细胞.(7)COX-2 mRNA表达用RT-PCR检测,细胞培养上清液中PGE2含量用ELISA测定.结果 (1)IL-1β干预A549细胞9 haCOX-2表达到高峰.(2)在体外,长片段COX-2 dsRNAs经Dicer酶消化获得D-siRNAs.(3)D-siRNAs可有效抑制A549细胞COX-2的表达并降低PGE2的分泌.结论 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA可有效抑制A549细胞COX-2的表达.     

不同年龄人群感染甲型H1N1流感病毒临床特征分析

目的 述不同年龄患者感染甲型H1N1流感病毒临床特征.方法研究对象为北京佑安医院2009年5月至2009年7月收治95例甲型H1N1流感确诊患者,按患者年龄分组并进行回顾性分析.结果 甲型H1N1流感患者平均年龄23.44±14.73岁.其中儿童及青壮年患者累计百分率达74.7%,为患者主体.从低龄组到高龄组患者,隐性感染率有逐渐增高趋势,差异无统计学意义.儿童组淋巴细胞比率明显高于其他年龄组,差异有统计学意义（P=0.039）.患者咽拭子核酸检测阴转时间为6.5±2.10（2～12）d,不同年龄组间咽拭子阴转时间无统计学差异（P=0.272）.13例（13.7%）患者出现并发症,6例合并肺炎患者中4例发生在儿童组患者.结论 甲型H1N1流感患者年龄分布明显不同于季节性流感,以儿童、青壮年为发病主体,在儿童患者中流感症状明显,肺炎是该人群的主要并发症.     

用MDCK细胞分离出禽H9N2亚型流感病毒

对患儿咽拭子用MDCK细胞病毒分离、患儿及其母亲血清H1测定以确定广州市是否有禽流感(H9N2)感染.咽拭子分离出禽流感H9N2及出现自身H9N2抗体,H1滴度160,母亲H9N2抗体1:20.可确定广州市有H9N2感染,并提示H9N2可通过人传播人而感染.     

深圳地区人和鸡群中H9N2亚型流感病毒病原学和血清流行病学调查

目的：了解甲型流感病毒N9N2亚型毒株在深圳地区鸡群和人群中的分布。方法：采用常规的鸡胚双腔法来分离病毒。抗体测定，采用红细胞凝集抑制（HI）试验和中和试验测定法。结果：从深圳地区农贸市场鸡群中分离到27株H9N2亚型流感病毒，但未能从人群中分离到H9N2病毒。约有26％人血清中检测到H9亚型毒株的抗体，（HI滴度≥20），同时还发现抗体阳性率和几何均数随人群年龄增长而增高，同时与职业有关。然而，在鸡群中H9毒株的抗体阳性率仅为7％。结论：禽H9N2毒株不仅能感染人，而且在深圳地区人群和禽类中较为广泛的分布。人H9N2很大可能来源于鸡的H9N2毒株。     

H5N1禽流感病毒NS1蛋白与干扰素诱导蛋白10表达的相关性研究

目的 研究高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒NS1蛋白对干扰素诱导蛋白10(IP-10)的影响.方法 分别将禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NS1基因、插入80-84位缺失氨基酸的NS1突变基因及流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的NS1基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染人支气管上皮细胞BEAS-2B,流式细胞仪检测转染细胞内IP-10的表达情况.结果 与pEGFP-N1对照组相比,三种NS1蛋白均能下调BEAS-2B细胞IP-10的表达(P<0.01),但三者之间下调程度差异无统计学意义(P>0.01).结论 A/Anhui/1/2005(H5N1)禽流感病毒单一NS1蛋白能够抑制BEAS-2B细胞IP-10表达,但这并不能完全阐明其与病毒致病性之间的关系.     

Natural co-infection of influenza A/H3N2 and A/H1N1pdm09 viruses resulting in a reassortant A/H3N2 virus

BackgroundDespite annual co-circulation of different subtypes of seasonal influenza, co-infections between different viruses are rarely detected. These co-infections can result in the emergence of reassortant progeny.Study designWe document the detection of an influenza co-infection, between influenza A/H3N2 with A/H1N1pdm09 viruses, which occurred in a 3 year old male in Cambodia during April 2014. Both viruses were detected in the patient at relatively high viral loads (as determined by real-time RT-PCR CT values), which is unusual for influenza co-infections. As reassortment can occur between co-infected influenza A strains we isolated plaque purified clonal viral populations from the clinical material of the patient infected with A/H3N2 and A/H1N1pdm09.ResultsComplete genome sequences were completed for 7 clonal viruses to determine if any reassorted viruses were generated during the influenza virus co-infection. Although most of the viral sequences were consistent with wild-type A/H3N2 or A/H1N1pdm09, one reassortant A/H3N2 virus was isolated which contained an A/H1N1pdm09 NS1 gene fragment. The reassortant virus was viable and able to infect cells, as judged by successful passage in MDCK cells, achieving a TCID₅₀ of 10⁴/ml at passage number two. There is no evidence that the reassortant virus was transmitted further. The co-infection occurred during a period when co-circulation of A/H3N2 and A/H1N1pdm09 was detected in Cambodia.ConclusionsIt is unclear how often influenza co-infections occur, but laboratories should consider influenza co-infections during routine surveillance activities.     

猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究

目的 研究2002年我国内地从猪群中分离的猪型(H1N1)毒株HA和NA基因来源。及其使猪致病的原因。方法 用PCR扩增目的基因，用P^GEM-T Easy Vector，4℃过夜连接，重组质粒转入DH-10B细菌，筛选阳性菌落，酶切鉴定，送六合通公司自动测序，并作进化树分析。结果 3株猪型(H1N1)病毒的HA和NA基因属猪型(H1N1)流感病毒，而不同于其他禽或人的H1N1亚型流感病毒。2002年猪型毒株由1991年猪型毒株演变而来。近来我国内地猪群中猪型毒株活动增强，其对猪能致病是由于病毒粒HA和NA蛋白抗原性发生变异所造成。结论 3株猪型病毒的HA和NA基因来源于猪型(H1N1)毒株。近来猪型毒株对猪具有致病性和活动增强是由于其HA和NA蛋白分子上氨基酸序列发生替换所造成。     

A preliminary panorama of the diversity of N1 subtype influenza viruses

N1 subtype influenza viruses have caused many epidemics and even a few pandemics in humans, pigs and fowls including 1918 human H1N1 pandemic, which killed 20-50 million people and the current avian H5N1 pandemic in the Eastern Hemisphere, which has caused great economic losses and posed a severe threat to human public health. To elucidate the whole diversity of N1 influenza viruses from a dynamic view, 202 neuraminidase (NA) sequences of N1 subtype influenza isolates were selected and analyzed in this study. Our results showed that N1 influenza isolates could be divided into three distinct lineages (Human, Classic Swine and Avian), which largely circulated in the humans, pigs and fowls respectively, though viruses in the Avian lineage could infect mammals and even there was a sublineage in the Avian lineage wholly isolated from pigs. The Avian lineage and the Human lineage, which have existed at least for decades, possibly began divergence around in 1890 through regression analysis. Both of the Human and Avian lineages could be further divided into some sublineages, and the correlation between these lineages (or sublineages) and their isolation places, isolation time, hemagglutinin (HA) subtypes, host species, virulence, or epidemics were discussed. The panorama of the diversity of N1 influenza viruses presented in this study provided a framework for the studies on the evolution and epidemiology of N1 influenza viruses.     

苏州市甲型H1N1流感病毒HA基因的分子演变和遗传特征分析

目的 对新型H1N1从2009年在苏州出现至2011年度基本消失整个过程中,苏州分离株血凝素( haemagglutinin,HA)基因的变化和分子特征进行了分析.方法 提取苏州分离株的RNA,以WHO推荐的引物扩增HA基因并测序.采用生物信息学软件对苏州毒株的HA进行详细的分子特征分析,并与疫苗株及全球和全国的代表性毒株进行比对分析.结果 与疫苗株相比,5株苏州株的核苷酸序列同源性在98.8％ ～99.4％之间,氨基酸序列同源性在98.8％～99.4％之间.5株苏州株中3株在1个抗原位点突变,2株有2个抗原位点突变,且有2个抗原位点突变的都是2011年分离株.糖基化位点、二硫键和受体结合位点都没有发生改变.5株苏州株和各地的分离株都表现出按年份聚类的特点.结论 详细分析了苏州地区新型H1N1流感病毒HA的分子特征,表明苏州毒株的抗原位点上出现氨基酸残基的变化,但仍处于稳态.     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

一起新型甲型H1N1流感疫情的临床和实验室特点

目的分析一起新型甲型H1N1流感疫情患者的临床和实验室特点。方法某部集体发病患者35例,均由核酸检测方法确诊;回顾调查患者的密切接触史、实验室检测结果、治疗和预后等。结果本次疫情收治的35人,密切接触平均1．7d出现临床症状,首发症状为发热占97．1％（34／35）,咽痛65．7％（23／35）,咳嗽51．4％（16／35）,肌肉酸痛31．4％（11／35）,头痛28．6％（10／35）。病毒核酸检测阴性的平均天数为4．5d,奥司他韦治疗,5d标准疗程,所有患者7d后痊愈出院。结论本次疫情为比较典型的新型甲型H1N1流感。