肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮细胞组织因子(TF)表达的影响,并探讨TF基因5’上游序列在TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法:应用细胞原位杂交技术检测TFmRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,检测及分析报告基因活性。结果:TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TFmRNA表达增强。在TF基因上游序列-244/+121bp存在时,TNFα、AngⅡ均可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-111/+121bp存在时TNFα、AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异,而且较-244/+121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论:TF基因上游-244/-112bp序列的存在对TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

丹参提取物单体对肿瘤坏死因子诱导内皮细胞组织因子表达的干预作用

研究丹参提取物单体(764—3)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF—α)诱导人血管内皮细胞(human vascular endothelial cell，HUVEC)组织因子(tissue factor，TF)基因表达的干预作用，及其对单个内皮细胞胞内游离钙([Ca^2 ]i)水平的影响，以探讨764．3对心血管血栓栓塞性疾病防治的可能机制。进行人脐静脉原代内皮细胞、ECV304细胞株的培养。采用限制性内切酶法，构建含有人TF基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，用TNF—α及764-3处理内皮细胞，测定细胞裂解物荧光素酶及β半乳糖苷酶活性。以Fluo3／AM为荧光指示剂，用激光扫描共聚焦显像系统观测[Ca^2 ]i的改变。结果发现在TF基因上游序列-244／ 121bp存在下，TNFα可使转染内皮细胞荧光素酶表达量比对照组明显增加，764-3使这种增加有所降低。而-111／ 121bp存在时，TNF—α组与对照组荧光素酶表达量无明显差异，均比-244／ 121bp存在时明显降低，此时，764-3并未引起荧光素酶表达量明显改变。激光扫描共聚焦显像显示，TNF—α可引起人内皮细胞[Ca^2 ]i持续缓慢升高，加入7643后[Ca^2 ]i迅速大幅度降低，逐渐恢复到基线水平。提示764—3可抑制TNF—α诱导的人内皮细胞TF基因表达增强，这种作用依赖于该基因上游序列-244／ 121bp的存在，推测胞内游离钙离子可能参与此抑制作用。     

5'上游序列对TNFα诱导内皮细胞血小板源生长因子-B链基因转录的调控作用

目的和方法:为探讨人血小板源生长因子(PDGF)-B链基因5'上游序列在TNFα诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用,本研究将构建的一系列含人PDGF-B链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,与内参照质粒pSV-β-Gal共转染培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别检测了不同浓度和不同持续时间TNFα作用下转染内皮细胞荧光素酶比活性,观察了5'上游序列的定向删切对TNFα诱导内皮细胞PDGF-B链基因转录的影响.结果和结论:不同浓度TNFα处理转染(重组报告基因质粒pSIS-1758/+43Luc)内皮细胞18h,荧光素酶的表达均有增加,在TNFα为200U/mL、400 U/mL和800 U/mL时,荧光素酶活性呈浓度依赖性增加(分别为P＜0.05,P＜0.05和P＜0.01);200U/mL TNFα分别处理9 h、18 h、36 h和72 h后,内皮细胞荧光素酶均有增加,自18 h开始其荧光素酶的表达量呈时间依赖性增加(分别为P＜0.05,P＜0.05和P＜0.01);在PDGF-B链基因上游序列-1758/+43 bp,-402/+43 bp或-189/+43 bp存在下,TNFα可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-84/+43 bp和-52/+43 bp存在时TNFα组与对照组荧光素酶表达量无明显差异,提示PDGF-B链基因上游序列-189/-85 bp范围内存在TNFα诱导反应的顺式调控元件.     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析。方法 进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞：①正常对照组;②10^-7mol／L,E2刺激组;③10^-7mol／L ZAL刺激组;④10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑤10～mol／L E2 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑥10^-7mol／L ZAL 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity,BLA)的变化。结果 转染pGL3-TF-171/ 71的各组细胞BLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593／ 71,pGL3-TF-316／ 71,pGL3-TF-236／ 71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异。结论 含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236bp-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。     

含人PDGF—B链基因不同上游序列报告基因的构建和表达

本研究构建了含人ＰＤＧＦＢ链基因不同上游序列的荧光素酶报告基因ｐＳＩＳ－１７５８／＋４３Ｌｕｃ和ｐＳＩＳ－４０２／＋４３Ｌｕｃ，经与ｐＳＶβＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＣｏｎｔｒｏｌＶｅｃｔｏｒ共转染血管内皮细胞后，测定了基础水平和ＴＮＦα作用下细胞裂解液中的荧光素酶和β半乳糖苷酶活性。结果表明：在ＴＮＦα作用下，ＰＤＧＦＢ链基因上游序列上调内皮细胞荧光素酶的表达，其主要调控区可能位于－１７５８／－４０３ｂｐ之间。     

血管紧张素转换酶2基因转染对人内皮细胞MIF表达的影响

目的：探讨重组血管紧张素转换酶2（ACE2）基因转染对体外培养的人血管内皮细胞中由血管紧张素（Ang）II诱导的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的影响。方法:克隆和构建含人ACE2基因全长的重组质粒（pACE2），并将之转染入人血管内皮细胞中。分别采用实时定量PCR和Western印迹技术检测转染细胞中的MIF mRNA与蛋白表达情况。结果: Ang Ⅱ（100 nmol/L）和Ang IV（100 nmol/L）刺激后均可诱导人血管内皮细胞中MIF mRNA及蛋白表达增加（P<0.01）。pACE2基因转染可明显抑制内皮细胞中由Ang II和Ang IV诱导的MIF mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: ACE2基因过表达可明显抑制人内皮细胞中炎症介质MIF的表达，提示ACE2基因具有一定的抗炎症效应。通过调节ACE2基因的活性和表达，很可能为炎症相关疾病如动脉粥样硬化治疗提供新的策略。     

LPS和TNF—α诱导血管内皮细胞ICAM—1蛋白表达的比较

目的和方法 采用细胞间免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜扫描技术,研究脂多糖（LPS）和肿瘤坏死因子α（TNF－α）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表面细胞间粘附分子－1（ICAM－1）表达的诱导作用。结果 与内皮细胞表明ICAM－1的基础表达相比,LPS可诱导内皮细胞表面ICAM－1表达在第8－24h显著增加,但第36h有较明显的下降;TNF－α也可诱导内皮细胞表面ICAM－1表达在第8－24h显著增加,并在36h仍维持在较高水平。LPS和TNF－α与内皮细胞ICAM－1表达之间存在剂量反应关系。结论 LPS和TNF－α可诱导血管内皮细胞ICAM－1的表达,但内皮细胞在表达ICAM－1时对LPS的长期刺激可能产生耐受性。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的细胞间粘附分子-1表达的影响

目的 :研究肿瘤坏死因子α(TNFα)和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对心肌细胞的细胞间粘附分子 - 1(ICAM - 1)表达的不同影响。方法 :运用免疫组化技术和流式细胞仪观察TNFα和AngⅡ对培养的乳鼠心肌细胞ICAM - 1表达量的影响。结果 :TNFα明显增加心肌细胞ICAM - 1表达量 ,以刺激 6h最明显 ,随时间作用延长表达量减少。AngⅡ对培养的心肌细胞ICAM - 1表达量无显著作用。结论 :TNFα是调节心肌细胞ICAM - 1表达的重要细胞因子。AngⅡ并没有调节心肌细胞ICAM - 1表达的作用     

5‘上游序列对TNFα诱导内皮细胞血小板源生长因子—B链基因…

目的和方法：为探讨人血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）－Ｂ链基因５‘上游序列在ＴＮＦα诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用,本研究将构建的一系列含人ＰＤＧＦ－Ｂ链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,与内参照质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌ共转染培养的人脐静脉内皮细胞,分别检测了不同浓度和不同持续时间ＴＮＦα作用下转染内皮细胞荧光素酶比活性,观察了５’上游序列的定向删切对ＴＮＦα诱导内皮细胞ＰＤＧＦ－Ｂ链基因转录的     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对人血管内皮细胞组织因子表达 …

已知组织因子异常表达可启动血液凝固机制。用细胞发色底物，ＲＴ－ＰＣＲ等方法分别从蛋白活性，基因表达水平研究与动脉样硬化及高血压发病相关的肿瘤坏死因子、血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞组织因子表达的影响。结果表明：肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ均诱导因管内皮细胞组织因子的表达，并使其ｍＲＮＡ表达增加。此项研究为进一步探讨动脉粥样硬化和高血压的共同发病机制打下了基础。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ对人血管内皮细胞组织因子表达的影响

已知组织因子异常表达可启动血液凝固机制。用细胞发色底物法、ＲＴ－ＰＣＲ等方法分别从蛋白活性、基因表 达水平研究与动脉粥样硬化及高血压发病相关的肿瘤坏死因子、血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞组织因子表达的影响。 结果表明：肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ均诱导血管内皮细胞组织因子的表达,并使其ｍＲＮＡ表达增加。此项研 究为进一步探讨动脉粥样硬化和高血压的共同发病机制打下基础。     

AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老及凋亡相关基因的表达

目的： 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老及凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。方法: 体外培养人脐静脉内皮细胞, 采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定内皮细胞存活率，用AngⅡ(10^-6mol/L)及valsartan（AngⅡ1型受体特异性拮抗剂）干预,分为实验对照组、AngⅡ诱导组及valsartan组，采用β-半乳糖苷酶染色和流式细胞术鉴定细胞衰老，通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学变化，并利用免疫细胞化学染色法、RT-PCR法和Western blotting分析各组细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表达水平。结果: 与对照组相比，10^-6mol/L AngⅡ诱导组存活的细胞数为对照组的（81.90±0.04)%; (80.10±6.81)%的细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性染色。流式细胞仪检测细胞周期停滞于G₀-G₁［(91.36±6.45)%］，证实细胞衰老；荧光显微镜可见明显的细胞凋亡［(31.84±2.86)%］。与AngⅡ诱导组相比，valsartan组Bcl-2mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.05), Bax mRNA及蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论: AngⅡ可诱导体外培养的HUVECs老化。经AngⅡ诱导的衰老HUVECs发生凋亡，提示细胞凋亡参与了AngⅡ诱导HUVECs细胞的衰老过程。AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老的分子机制之一可能与Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达的失衡有关。缬沙坦对血管内皮细胞衰老有一定保护作用。     

AngⅡ通过AP一1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的表达

目的明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子（migrationinhibitoryfactor,MIF）表达的转录因子。方法构建长度依次递减的MIF基因5’调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化人人脐静脉内皮细胞EAhy926。利用双荧光基因报告系统检测AngII诱导后MIF基因5’调控区不同区段的转录活性。通过突变转录活性高的MIF5’调控区序列,初步确定可能的转录因子结合序列。设计针对可能的转录因子的小干扰RNA（siRNA）序列,并构建其表达载体,分别检测候选转录因子沉默的HEAY926中MIF的转录活性和表达水平。结果双荧光基因报告检测显示,Ang11调控MIF表达的高转录活性区段位于-507至-188之间。序列突变和荧光素酶活性分析显示,MIF基因5’调控区-350至～339间的AP一1结合序列决定了MIF基因的转录活性。AP-1沉默后的HEAY926中AngⅡ调控的MIF转录活性显著降低（P〈0．05）,MIFmRNA和蛋白的表达水平也显著降低（P〈0．05）。结论AngII通过转录因子AP一1调控内皮细胞中MIF的表达。     

转录因子GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节Tie2基因的表达

目的：探讨在炎症刺激因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的炎症反应中转录因子GATA家族成员是否参与了Tie2基因的转录调控。方法: 采用实时定量PCR测定TNF-α作用前后人主动脉内皮细胞（HAECs）和肺动脉内皮细胞（HPAECs）中GATA家族成员GATA2、GATA3 mRNA的表达,利用荧光素酶活性检测研究GATA转录因子能否激活Tie2基因启动子,并采用电泳迁移变动分析（EMSAs）和超级迁移率变动试验（supershift）研究GATA转录因子是否通过与Tie2基因启动子结合,从而激活Tie2基因的表达。结果: TNF-α可诱导人血管内皮细胞HAECs和HPAECs中转录因子GATA2的表达,高表达的GATA2可与Tie2基因启动子上的（T/A）GATA(A/G)序列结合,激活Tie2基因启动子,从而上调Tie2基因的表达。结论: GATA转录因子家族成员GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节了Tie2基因的表达。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素（α—MSH）对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用，探讨α—MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α—MSH处理ECV304细胞，或在LPs／TNF-α处理的同时加不同浓度的α—MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8，以Greiss法测定NO，RT-PCR检测组织因子（TF）mRNA，Western blot检测TF蛋白表达。结果显示，α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α，但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TFmRNA，而α—MSH抑制这种上调作用，并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α—MsH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

Ghrelin对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞损伤保护作用的研究

目的研究促生长激素释放肽Ghrelin对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）体外诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用。方法体外培养的HuVEcs，随机分为6组：正常对照组；Ghrelin（10^-7mol／L）组；AngⅡ（10^-7mol／L）组；AngⅡ（10^-7mol／L）＋Ghrelin不同浓度组：（Ghrelin 10^-7mol／L、10^-7mol／L和10^-7mol／L三个浓度组）。每组设6个复孔。用AngⅡ和Ghrelin联合干预细胞18h后，采用放射免疫方法测定内皮素-1（ET-1）含量；硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量；流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果Ghrelin呈浓度依赖性地显著减少AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞的ROS生成及ET-1释放，且明显促进NO生成（P〈0．05）。结论Ghrelin对AngⅡ体外诱导的HUVECs损伤有保护作用。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞组织因子表达增强

目的: 研究同型半胱氨酸（Hcy）诱导人血管平滑肌细胞（VSMCs）组织因子（TF）表达的作用，及其对核转录因子（NF-κB）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。 方法: 培养人脐动脉VSMCs，将不同浓度的Hcy和/或NF-κB抑制剂PDTC与VSMCs孵育不同时间，用RT-PCR方法检测TF mRNA表达，用Western blotting检测核NF-κB水平，用流式细胞术（FCM）检测细胞表面TF蛋白水平和iNOS水平。 结果: 10 μmol/L Hcy作用4 h，TF表达开始升高，500 μmol/L达峰值，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF mRNA；对照组VSMCs细胞膜表面有低水平的TF蛋白表达，10 μmol/L Hcy作用4 h即可诱导VSMCs表达TF蛋白，500 μmol/L 达高峰，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF；500 μmol/L Hcy作用1 h，细胞核NF-κB水平明显升高，Hcy可诱导VSMCs NF-κB活化;NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制Hcy对TF mRNA和细胞TF表达的诱导作用；单独Hcy作用不能诱导VSMCs表达iNOS。 结论: Hcy能显著诱导VSMCs表达TF，增强VSMCs的NF-κB活化，从而介导TF基因表达和蛋白合成，通过NF-κB介导VSMCs表达TF可能是Hcy导致AS、血栓形成的重要机制。     

血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞整合素β3表达的影响

目的和方法：本实验采用细胞ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ的方法分别从蛋白质和ｍＲＮＡ水平对血管紧张素Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）作用下的内皮细胞表面整合素β３的表达进行检测。结果：１０－８ｍｏｌ／Ｌ～１０－５ｍｏｌ／Ｌ的Ａｎｇ－Ⅱ在蛋白质水平能够促进内皮细胞整合素β３表达（Ｐ＜０．０５），且呈剂量依赖性。１０－６ｍｏｌ／Ｌ的Ａｎｇ－Ⅱ作用培养的人脐静脉内皮细胞１８ｈ后，细胞整合素β３ｍＲＮＡ量为正常对照组的１５倍。结论：提示Ａｎｇ－Ⅱ促进内皮细胞表面整合素β３的表达可能是单核细胞和内皮细胞之间粘附功能增加的机制之一。     

血管紧张素Ⅱ2型受体对大鼠血管平滑肌增殖的影响及其机制

目的：观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）对培养的大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC）增殖的影响。方法： 将AT2R cDNA转染到培养的大鼠VSMC中， 分别观察AngⅡ、AngⅡ＋losartan、AngⅡ+PD123319等不同处理因素处理对VSMC的 细胞数目以及PCNA、 NOS表达的影响。 结果：losartan 处理组细胞数目和PCNA表达量少于AngⅡ处理组，NOS表达量高于AngⅡ处理组， 而PD123319处理组细胞数目和PCNA表达量显著高于AngⅡ处理，NOS表达量较之为少。结论： 激活AT2R能拮抗AngⅡ的由AT1R介导的促细胞增殖作用，这种作用可能与激活AT2R后NOS表达增多使 NO合成增多有关。     

保护性基因A20在血管内皮细胞中的诱导表达

目的：研究人Th2细胞因子对牛主动脉内皮细胞（BAEC）诱导表达保护性基因A20的影响，探讨人Th2细胞因子对异种VEC具有保护效应的机制。方法：建立BAEC的体外培养体系，用浓度为20μg/L的各Th2细胞因子（hIL-4、hIL-10、hIL-13）分别孵育BAEC2h后，再与肿瘤坏死因子α（TNF-α、4μg／L）共孵育24h后收集细胞；应用RT-PCR方法检测各组BAEC中A20mRNA的表达。结果：用Th2细胞因子在一定浓度内预处理BAEC后，能明显诱导BAEC表达保护性基因A20。结论：Th2细胞因子对BAEC的保护作用与Th2细胞因子诱导保护性基因A20在BAEC中的表达有关。