人脑胶质瘤cDNA文库的构建

作者用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取人脑胶质瘤总ＲＮＡ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离ｐｏｌｙ（Ａ￣＋）ＲＮＡ为模板，合成的ｃＤＮＡ长度为０．２～５ｋｂ。胶质瘤ｃＤＮＡ插入片段克隆到λｇｔ１１载体，所获得的重组子在体外进行包装。该ｃＤＮＡ文库滴度为１．１２×１０￣５，克隆效率为４．８×１０￣３／ｎｇｃＤＮＡ。本文库为研究人脑胶质瘤的基因结构与功能提供了重要基础。     

人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24%,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02%;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36%,0.5～1 kb的占63.64%.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.     

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用．近年来，随着分子生物学技术的发展，cDNA文库构建方法有了很大改进和提高．就cDNA文库构建的方法作一综述，     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

用λgt11载体构建人脑胶质瘤基因文库

自人脑胶质瘤手术标本中提取mRNA,逆转录合成cDNA,在T_4DNA 连接酶作用下,与一头是平末端,另一头是EcoR I 粘性末端、内含Not I 切点的插头相连,经T_4多聚核苷酸激酶磷酸化后,再与脱磷酸处理过的λgt11 臂连接,形成重组λgt11DNA。体外包装,构建了一个库容量含1.02×10~6重组子的人脑胶质瘤cDNA 基因文库。克隆效率为1.08×10~7pfu/μg cDNA。重组百分比为96.2%。     

全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略

基因全长cDNA克隆是研究基因功能的前提之一。新基因全长cDNA克隆的方法很多，目前比较可行且应用较多的主要是cDNA库筛选。本主要介绍了近年来比较常用的全长cDNA库的构建及全长cDNA的克隆(包括“电子”基因克隆)的策略和方法及其进展。     

人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

0　引言2 0世纪 90年代起 ,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手 ,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要 [1] .我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体 ,其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段 .找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义 .利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建c DNA文库 [2 ] ,继而进行筛选、克隆等 .我们选取与几株单抗的免疫荧光及 Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株 HHCC作为建库材料来源 ,以λgt11DNA为载体 ,构建了人肝癌细胞 c DN…     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

人源性大肠癌抗原基因噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法从人大肠癌组织中提取总RNA,用RT-PCR合成cDNA第1链,用LD-PCR合成cDNA第2链,除去小于500 bp的小片段,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成cDNA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,滴定文库的滴度,确定文库容量大小;用ITPG诱导和X-gal显色测定重组率;用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果构建成含2.39×106 pfu/ml重组噬菌体的人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,重组率为97.5%,插入cDNA片段大小范围从600~4 000 bp,平均长约1 400 bp。结论成功构建高质量人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因。     

快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库

目的快速构建哺乳动物细胞表面展示的全长人抗体基因库。方法分离外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)和全长Kappa型轻链(LCκ)基因库,分别插入载体pDGB-HC-TM,化学转化感受态大肠杆菌DH5α,构建抗体的轻、重链基因库,然后将其联合转染CHO细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在CHO细胞表面的表达。结果构建的非特异性IgG1-Kappa抗体基因库,重链库容量达2.6×105,轻链库容量达2.0×105,理论库容量高达5.2×1010。随机从重链库和轻链库各挑选10个克隆送测序,重链10个克隆的DNA序列分析显示8个含有正确的阅读框架,轻链10个克隆的DNA序列分析显示全部含有正确的阅读框架。流式细胞仪分析显示来自轻链库的10个克隆、重链库的8个克隆均可检测到抗体在CHO细胞表面的表达。用所构建的轻重链抗体库共转染CHO细胞,流式细胞仪分析可检测到抗体在细胞表面的表达,阳性细胞比例达到31.5%,说明所构建的抗体库能够在CHO细胞表面成功展示全长抗体。结论采用本研究建立的哺乳动物细胞展示技术,可在2周内成功构建库容量大且多样性好的全人源抗体基因库,用于高亲和力特异性抗体的筛选。