与放疗抵抗相关的长链非编码RNA在不同放疗敏感性结直肠癌细胞株中的表达

目的 筛选与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的长链非编码RNA（lncRNA）.方法 将HT29、SW480、RKO、Lovo和HCT116等5株结直肠癌细胞梯度照光后行克隆形成实验,通过细胞存活率（SF2值）来检测5株细胞的放疗敏感性差异;利用高通量lncRNA芯片筛选在SW480、RKO和Lovo细胞株中两两比较表达差异均大于2倍的lncRNA,并通过实时定量PCR进一步检测所选lncRNA在5株结直肠癌细胞中的表达差异.结果 5株结直肠癌细胞放疗敏感性由低至高（即SF2值由高至低）依次为HT29 （0.83±0.03）、SW480 （0.69±0.02）、RKO （0.53±0.02）、Lovo （0.47±0.05）和HCT116（0.32±0.03）（P＜0.01）.lncRNA芯片筛选得到5种与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的lncRNA基因,其中R05532、NR_015441和NR_033374基因表达水平与细胞放疗抵抗呈正相关（均P＜0.01）,而NR_073156和AA745020基因表达水平与细胞放疗抵抗无明显相关性（均P＞0.05）.结论 R05532、NR_015441和NR_033374三种lncRNA可能成为结直肠癌细胞放疗敏感性的预测分子,其高表达提示放疗抵抗。     

结直肠癌细胞辐射敏感性的表达谱研究

目的筛选结直肠癌细胞辐射敏感相关基因。方法采用人全基因组表达谱芯片获得不同辐射敏感性的两株细胞（Lovo与SW480）之间的基因表达谱．分析比较两者之间基因的差异表达情况。结果Lovo组与SW480组数据比较后．筛选出2倍以上差异表达基因中上调基因908个．其中在Lovo细胞组中较高表达的基因有CEACAM5、THBS1、SERPINE2、ARL7和HPGD,与辐射敏感高度相关;下调基因1312个,其中在SW480细胞中较高表达的基因主要有SCD、NQ01、LYZ、KRT20和ATP1B1．与辐射抵抗有关。结论采用基因方法研究结直肠癌辐射敏感性将更有利于辐射敏感相关基因的筛选。     

表皮生长因子受体表达及其下游基因突变与结直肠癌细胞放射敏感性的关系

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）表达及其下游基因K-ras、B-rM和PIK3CA突变对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法对9株人结直肠癌细胞株应用实时定量RT-PCR检测EGFR表达,并检测K-ras、B—raf和PIK3CA基因的突变状态;对各细胞株行梯度剂量射线照射后,行克隆形成实验明确其放射敏感性、行Hoechst33258染色凋亡形态学观察和流式细胞术检查细胞凋亡及细胞周期。结果人结直肠癌细胞株EGFR表达与放疗抵抗呈正相关（r=O．717．P=0．030）,~K3CA突变与放疗敏感性有关（t=2．401,P=0．047）,K—ras和B．raf突变与放疗敏感性无关（均P〉O．05）。放疗敏感细胞株（HCTll6）总凋亡率在低放射剂量（2Gy）时即显著增加,并随放射剂量增加而继续增加（P〈0．05）,而放疗抵抗细胞株（HT29）总凋亡率只有放射剂量较大时（6Gy）才明显增加。G1／G。期HCTll6细胞株比例随放疗剂量增加显著降低（P〈0．05）,而HT29细胞株G1／G。期比例在放疗剂量增加时无明显变化（P〉0．05）。结论EGFR通路中多个位点同时参与了结直肠癌细胞的放疗抵抗或敏感作用,EGFR高表达与放疗抵抗相关,PIK3CA突变与放疗敏感有关,放疗抵抗机制可能与抑制细胞凋亡和增加细胞在G1／Go期停顿相关。     

腺病毒介导的Bcl-XL shRNA对结肠癌细胞的体外抗肿瘤性

目的研究腺病毒介导的Bcl—XL shRNA对结肠癌细胞株的体外抗肿瘤性。方法将已有的Bcl-XL腺病毒进行扩增纯化．并通过反转录反应分析该腺病毒在mRNA水平对Bcl-XL的表达调控。通过MTT检测及克隆形成实验,了解该腺病毒对结直肠癌细胞株（Lovo细胞株）的体外杀伤作用。结果Ad／Bcl．XLshRNA作用于Lovo细胞株导致Bcl—XL mRNA表达水平下降。与对照腺病毒Ad／GFP相比,Ad／Bcl-XL shRNA显著抑制Lovo细胞的增长（P〈0．05）,且该抑制效应呈剂量和时间依赖性;显著抑制Lovo细胞的克隆形成（P〈0．05）,且该抑制效应呈剂量依赖性。而Ad／Bcl—XL shRNA对正常人成纤维细胞（NHFB）无明显杀伤作用。结论腺病毒介导的Bcl-XL shRNA对Lovo细胞株具有杀伤作用,可能存在潜在的结肠癌治疗价值。     

Smoothened（Smo）基因在结肠腺癌Lovo细胞的表达及其作用

目的探讨Smoothened（Smo）基因在结肠腺癌Lovo细胞的表达水平及在细胞增殖与凋亡过程中的作用。方法应用Westernblot及半定量RT—PCR检测结肠腺癌Lovo细胞内Smo基因的表达水平,再应用RNAi技术降解Lovo细胞内的SmomRNA表达,然后应用MTT法、流式细胞术检测SmomRNA被降解后Lovo细胞增殖水平与凋亡水平的变化。结果结肠腺癌Lovo细胞内有Smo蛋白及SmomRNA的高表达,SmomRNA被降解后,Lovo细胞的增殖水平明显抑制（P〈0．05）,凋亡率明显升高（P〈0．001）。结论结肠腺癌Lovo细胞的发生与Smo基因的高表达有关,Smo基因参与结直肠癌的增殖与凋亡过程。     

应用RNA干扰下调多药耐药蛋白4表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰技术（RNAi）稳定下调人结直肠癌细胞株HCT116中MRP4的表达。将HCT116细胞分为未感染任何病毒的细胞株（CON）、加阴性对照病毒感染的细胞株（NC）和加RNAi靶点病毒感染的细胞株（KD）3组,应用实时定量RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平检测MRP4表达变化,以验证RNAi的有效性。4Gy剂量照射后24h,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞增殖,比较RNAi后HCT116细胞株照射敏感性的差异。结果成功构建并转染慢病毒质粒,获得稳定沉默MRP4表达的HCT116-KD细胞株,HCT116-KD细胞株MRP4mRNA和蛋白表达水平较对照均明显下调（P〈0．05）。照射后24h,KD细胞株凋亡率为（71．7±0．8）％,明显高于CON组[（56．1±0．9）％]和NC组[（59．8±0．8）％]（P〈0．05）。照射后48h和72h,KD细胞增殖能力较对照组明显下降（火0．05）。结论MRP4在结直肠癌细胞中的表达水平与照射耐受显著相关,应用慢病毒感染RNA干扰下调MRP4表达可以增强结直肠癌细胞照射敏感性。MRP4有可能成为预测放疗敏感性的分子标志物。     

可溶性血管内皮生长因子受体1基因转染结肠癌Lovo细胞的实验研究

目的研究人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFlt-1）基因转染结肠癌Lovo细胞后对其细胞生长及培养上清液VEGF含量的影响。方法使用脂质体介导方法把含sFlt-1基因的重组质粒pcDNA3-sFlt-1转染Lovo细胞,通过RT-PCR及ELISA法鉴定sFlt-1的表达,MTT比色法及ELISA法检测该蛋白对Lovo细胞生长及VEGF含量的影响。结果pcDNA3-sFlt-1成功转染Lovo细胞．ELISA法检测到转染后培养上清液中sFlt-1蛋白的表达．MTT实验显示此培养上清液可抑制Lovo细胞的生长．转染后2、14、21和28d细胞培养上清的抑瘤率分别为（23．92±9．16）％、（13．98±10．21）％、（22．54±11．92）％和（33．43±9．34）％,与未转染组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）;ELISA证实细胞培养上清中VEGF的含量降低,与未转染组比较,差异亦均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论将sFlt-1基因转染至结肠癌Lovo细胞后,可获得具有生物活性的sFlt-1蛋白．抑制癌细胞生长。     

结肠癌多药耐药性相关基因筛选与鉴定

目的筛选结肠癌多药耐药相关基因,探讨结肠癌多药耐药的机制。方法通过逐步递增氟尿嘧啶（5-FU）浓度孵育结肠癌Lovo细胞,建立耐药细胞株Lovo／5-FU。M1Tr法检测Lovo／5-FU细胞对5-FU和顺铂（CDDP）的敏感性。采用二维电泳-质谱联用技（2DE—MS）术比较Lovo和Lovo／5-FU两株细胞间差异表达蛋白,并采用Western blot法鉴定筛选蛋白。结果与Lovo相比,Lovo／5-FU细胞对5-Fu和CDDP的IC。值分别升高31倍和3倍（均P〈0.01）。通过2DE—MS筛选得到。在耐药株中CAP—G和RhoGD12表达上调,6-PGL、DCI、Prdx-6和Maspin表达下调。Western blot检测显示．Lovo／5-FU细胞中RhoGD12和CAP-G较Lovo增高6．14倍和2．98倍（均P〈0．01）．而Maspin则明显下降至Lovo中的5．2％（P〈0．01）。结论结肠癌耐药性的产生是多基因、多通路改变的结果。CAP—G、RhoGD12、Masoin是潜在的结肠癌多药耐药相关基因。     

选择性诱生型一氧化氮合酶抑制剂对人结直肠癌Lovo细胞生长的影响

目的研究选择性诱生型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂氨基胍（AG）对人结直肠癌细胞株Lovo增殖与凋亡的影响，并对其作用机制进行初步探讨。方法应用四唑盐（MTT）比色法检测AG对Lovo细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测分析不同浓度AG作用后Lovo细胞的凋亡率和细胞周期分布变化，并用丫啶橙结合溴化乙锭染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态学改变。结果AG 0．5 mmol／L组和AG 1．0 mmol／L组的A值与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组在不同浓度AG作用24、48和72h后A值比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。Lovo细胞生长抑制率曲线显示，AG对Lovo细胞生长的抑制率呈明显的时间和浓度依赖性。流式细胞分析显示，随AG浓度的增高，Lovo细胞G0／G1期比率增高，S期与G2/M期则相应降低（P〈0．05）；SPF值和增殖指数（PI）降低，凋亡率增加（P〈0．05）。AG作用于Lovo细胞24h后细胞体积缩小、核固缩、荧光染色增强及凋亡小体形成。结论AG可抑制Lovo细胞的增殖。促进细胞凋亡；其作用的可能机制为氨基胍阻止Lovo细胞周期的进展。     

JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路对结肠癌细胞增殖迁移的影响

目的探讨JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路在结肠癌细胞增殖迁移中的作用。方法应用JAK2抑制剂AG490处理人结肠癌Lovo细胞株。采用MTT法进行细胞增殖实验：采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;用免疫荧光染色和Western blot检测Lovo细胞中波形蛋白和磷酸化STAT3（P—STAT3）的表达水平。结果AG490处理后,Lovo细胞增殖明显受到抑制．且呈剂量依赖性和时间依赖性（P〈0．05）。细胞划痕后24h,AG490处理组（实验组）的细胞划痕宽度恢复20％,而对照组划痕宽度恢复60％（P〈0．05）。实验组Lovo细胞中P—STAT3和波形蛋白蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路参与调控人结肠癌细胞的增殖和迁移。     

Polo样激酶1在结肠直肠癌组织中的表达及其在结肠直肠癌细胞增殖中的作用

目的：探讨Polo样激酶1（PLK1）在结肠直肠癌组织中的表达及体外RNA干扰抑制plk1对结肠直肠癌细胞增殖的影响。方法：应用免疫组化法测56例结肠直肠癌病人的癌组织和癌旁正常组织中PLK1及PCNA的表达;用Western印迹法测肠癌主要细胞株中PLK1的表达;针对plk1基因设计3条小干扰RNA片段,瞬时转染高表达结肠直肠癌细胞株,采用实时定量PCR及Western印迹法测转染后PLK1的基因及蛋白的表达水平;CCK-8法测细胞增殖能力。结果：结肠直肠癌组织中PLK1、PCNA的表达明显高于癌旁正常组织（P〈0.05）,两者的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和浸润深度均有相关性（P〈0.05）,且两者间的表达呈正相关（P〈0.05）。Western印迹法筛选出SW1116细胞株PLK1表达最高,下调PLK1表达后,其增殖能力较对照组都有所下降（P〈0.05）。结论：PLK1在结肠直肠癌组织中呈过表达,可能在结肠直肠癌细胞增殖调节失衡中起重要作用,并进一步促进其迁移和浸润,其有望成为评估结肠直肠癌进展及预后的一个重要指标。     

Sema4D蛋白高表达与结直肠癌血管形成和临床进展的相关性

目的：探讨轴突导向因子4D（Semaphorin4D,Sema4D）在结直肠癌组织中的表达及结肠癌细胞分泌Sema4D对血管形成的影响。方法：采用免疫组织化学SP法检测86例结直肠癌组织和52例正常结直肠组织中Sema4D的表达,并分析其与临床病理特征的关系;单纯血管内皮细咆组为空白对照组,结肠癌Lovo细胞和血管内皮细胞共培养组为实验组,应用ELISA检测2组Sema4D蛋白的表达,并观察其对内皮细胞成管的影响。结果：Sema4D蛋白在结直肠癌组织阳性表达率为60％,在正常结直肠组织中阳性表达率为12％,差异有统计学意义（P〈0．05）,且Sema4D蛋白表达与组织分化类型、TNM分期和淋巴结转移明显相关（P〈0．05）,而与年龄、肿瘤大小无关（P〉0．05）;ELISA检测结果显示,对照组和实验组Sema4D蛋白分别为（663．54±21,59）pg／mL、（1320．99±28．42）pg／mL（P〈0．05）;内皮细胞管形成实验显示,对照组和实验组小管数目分别为7．25±1．26、15．25±0．96（P〈0．05）。结论：Sema4D蛋白表达与结直肠癌组织分化类型、TNM分期和淋巴结转移相关;Sema4D蛋白促进内皮细胞管形成。     

低氧诱导因子-1α和轴突导向因子4D在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的比较低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和轴突导向因子4D（Sema4D）在结直肠癌组织和正常组织中的表达,探讨两者之间的相关性及临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测86例结直肠癌组织和52例正常组织中HIF-1α和Sema4D的表达,并分析其与结直肠癌临床病理特征及预后的关系。结果结直肠癌组织中HIF-1α和Sema4D蛋白阳性表达率显著高于正常组织[分别为58．1％（50／86）比7．7％（4／52）,X2=34．624,P〈0．01;60．5％（52／86）比11．5％（6／52）,x2=31．839,P〈0．01]。HIF-1α和Sema4D蛋白与结直肠癌组织分化程度（P／0．003,P=0．010）、TNM分期（P=0．003,P=0．017）和淋巴结转移（P=0．003,P=0．020）明显有关;且两者表达呈正相关（r=0．567,P〈0．01）。全组患者5年生存率为37％。其中HIF-1α蛋白阳性和阴性表达者的5年生存率分别为24％和56％（P=0．003）;Sema4D蛋白阳性和阴性表达者的5年生存率分别为23％和59％（P=0．001）。Cox多因素分析显示,Sema4D表达是结直肠癌患者的独立预后因素（P=0．026）,而HIF-1α表达不是其独立预后因素（P=0．501）。结论HIF-1α和Sema4D具有协同关系,两者蛋白的联合检测,可为预测结直肠癌的预后判断提供参考。     

细胞周期素D1（cyclin D1）和Ki67蛋白在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨细胞周期素D1（cyclinD1）、Ki67蛋白在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化方法检测28例ESCC组织和33例食管炎组织中cyclin D1蛋白、Ki67蛋白的表达。结果在ESCC与食管炎组织中cyclin D1阳性表达率分别为60.7%（17/28）和33.3%（11/33）（χ2=4.573,P=0.032）,Ki67标记指数（Ki67LI）分别为（49.21±25.15）%和（11.62±9.87）%（t=7.908,P=0.000）。ESCC组TNM分期中Ⅰ期cyclin D1阳性表达率为14.3%（1/7）,Ⅱ期为55.6%（5/9）,Ⅲ期为85.7%（6/7）,Ⅳ期为100%（5/5）,Ⅲ期与Ⅰ期、Ⅳ期与Ⅰ期相比,差异有显著性（P值分别为0.029,0.015）。有淋巴结转移者cyclin D1阳性表达率为90.9%（10/11）,无淋巴结转移者为41.2%（7/17）（P=0.016）。28例ESCC随访6～34个月,（25.0±4.2）月,死亡4例（3例为原发病进展,1例脑血管意外）,生存19例,失访5例。结论cyclin D1的表达与进展期肿瘤、淋巴结转移有关。Ki67在肿瘤中高表达,表达强弱与肿瘤分化程度及肿瘤分期无关。     

Survivin和RASSF1A基因在大肠癌中的表达及其临床意义

为研究大肠癌组织中生存素(survivin)基因与Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因表达与大肠癌发生、发展的关系,利用逆转录PCR技术,测定60例大肠癌组织及20例癌旁组织中survivin基因与RASSF1A基因的mRNA表达情况;利用甲基化特异性PCR(MSP)技术对RASSF1A启动子甲基化情况进行了鉴...