腺病毒介导的Bcl-XL shRNA对结肠癌细胞的体外抗肿瘤性

目的 研究腺病毒介导的BcI-XL shRNA对结肠癌细胞株的体外抗肿瘤性.方法 将已有的Bcl-xl腺病毒进行扩增纯化,并通过反转录反应分析该腺病毒在mRNA水平对Bcl-XL的表达调控.通过MTT检测及克隆形成实验,了解该腺病毒对结直肠癌细胞株(Lovo细胞株)的体外杀伤作用.结果 Ad/Bcl-XL shRNA作用于Lovo细胞株导致Bcl-XL mRNA表达水平下降.与对照腺病毒Ad/GFP相比,Ad/Bcl-XL shRNA显著抑制Lovo细胞的增长(P＜0.05),且该抑制效应呈剂量和时间依赖性;显著抑制Lovo细胞的克隆形成(P＜0.05),且该抑制效应呈剂量依赖性.而Ad/Bcl-XL shRNA对正常人成纤维细胞(NHFB)无明显杀伤作用.结论 腺病毒介导的Bcl-XL shRNA对Lovo细胞株具有杀伤作用,可能存在潜在的结肠癌治疗价值.     

JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路对结肠癌细胞增殖迁移的影响

目的探讨JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路在结肠癌细胞增殖迁移中的作用。方法应用JAK2抑制剂AG490处理人结肠癌Lovo细胞株。采用MTT法进行细胞增殖实验：采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;用免疫荧光染色和Western blot检测Lovo细胞中波形蛋白和磷酸化STAT3（P—STAT3）的表达水平。结果AG490处理后,Lovo细胞增殖明显受到抑制．且呈剂量依赖性和时间依赖性（P〈0．05）。细胞划痕后24h,AG490处理组（实验组）的细胞划痕宽度恢复20％,而对照组划痕宽度恢复60％（P〈0．05）。实验组Lovo细胞中P—STAT3和波形蛋白蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路参与调控人结肠癌细胞的增殖和迁移。     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

腺病毒载体介导的Polo样激酶1短发夹环RNA对胶质瘤体内外增殖的抑制作用

目的探讨重组腺病毒载体介导的Polo样激酶1（PLK1）短发夹环RNA（shRNA）对人胶质瘤细胞株U251在体内外增殖的抑制作用。方法设计并合成针对PLK1的shRNA,并克隆至真核表达载体pEGFP—H1上,再将H1启动子和shRNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack上,通过在携带有pAdeasy-1质粒的BJ5183细菌内同源重组,生成针对PLK1的shRNA重组腺病毒载体pAD-H1／PLK1,经293细胞包装产生重组腺病毒AD-H1／PLK1,感染U251细胞。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）的方法检测U251细胞PLK1mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞G2／M期转变情况,以噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的增殖活性。同时制备裸鼠U251细胞移植瘤模型并注射重组腺病毒,观察肿瘤生长情况。结果成功构建针对PLK1基因的RNA干扰腺病毒表达载体,与AD-H1组比较AD-H1／PLK1组在转染24h和48hU251细胞PLK1mRNA表达水平分别降低50．4％（P〈0．01）和71．9％（P〈0．01）。且感染AD-H1／PLK1病毒48h后的U251细胞凋亡率从8．3％升至65．6％（P〈0．01）,而G2／M期的细胞从21．5％增至51．4％（P〈0．01）,细胞的增殖能力则下降50％（P〈0．01）。体内实验表明重组腺病毒载体介导的PLK1shRNA也明显抑制肿瘤生长（P〈0．01）。结论腺病毒介导的RNA干扰技术可有效降低PLK1在胶质瘤细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性。     

长链非编码RNA调节细胞周期素D1表达对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响

目的筛选影响结直肠癌细胞辐射敏感性的长链非编码RNA（1ncRNA）并探讨其作用机制。方法选取RKO和Lovo结直肠癌细胞株梯度照光后行克隆形成实验。应用单击多靶数学模型计算存活分数SF2值并绘制剂量存活曲线：高通量IncRNA／mRNA芯片筛选在RKO与Lovo、以及2Gv照光前后RKO细胞中表达差异2倍以上的lncRNA基因和蛋白编码基因：采用GeneOntology联合Pathway综合分析阳性表达基因主要作用通路：实时PCR进一步检测验证RKO细胞株照光前后P53、P21、细胞周期素（cyclin）D1表达变化。结果克隆形成实验显示,Lovo细胞株SF2=0．47．RKO细胞株SF2=0．53,Lovo辐射敏感性显著高于RKO（P〈O．05）。高通量lncRNA／mRNA芯片筛选得到阳性表达长链非编码RNA基因268条,蛋白编码基因270条;GeneOntologv联合Pathway综合分析显示：细胞周期相关基因所占比重最大（38．6％）,并有多条lncRNA表达水平与cvclinD1编码基因CCNDl组间表达差异显著相关。RKO与Lovo两株细胞P53和P21相对表达量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,RKO细胞cyclinD1相对表达量明显高于Lovo细胞（P〈0．05）;RKO细胞株经2Gy剂量照射前后,P53和P21相对表达量的差异无统计学意义（P〉0．05）,而cvclinD1表达明显下调（P〈0．05）。结论incRNA可能通过形成转录复合物与CCNDl基因结合,调节cvclinD1蛋白表达进而影响结直肠癌细胞辐射敏感性：且lncRNA对cvclinD1表达的调节不依赖于P53-P21-cyclinD1通路。     

结肠癌多药耐药性相关基因筛选与鉴定

目的筛选结肠癌多药耐药相关基因,探讨结肠癌多药耐药的机制。方法通过逐步递增氟尿嘧啶（5-FU）浓度孵育结肠癌Lovo细胞,建立耐药细胞株Lovo／5-FU。M1Tr法检测Lovo／5-FU细胞对5-FU和顺铂（CDDP）的敏感性。采用二维电泳-质谱联用技（2DE—MS）术比较Lovo和Lovo／5-FU两株细胞间差异表达蛋白,并采用Western blot法鉴定筛选蛋白。结果与Lovo相比,Lovo／5-FU细胞对5-Fu和CDDP的IC。值分别升高31倍和3倍（均P〈0.01）。通过2DE—MS筛选得到。在耐药株中CAP—G和RhoGD12表达上调,6-PGL、DCI、Prdx-6和Maspin表达下调。Western blot检测显示．Lovo／5-FU细胞中RhoGD12和CAP-G较Lovo增高6．14倍和2．98倍（均P〈0．01）．而Maspin则明显下降至Lovo中的5．2％（P〈0．01）。结论结肠癌耐药性的产生是多基因、多通路改变的结果。CAP—G、RhoGD12、Masoin是潜在的结肠癌多药耐药相关基因。     

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

生长抑素抑制人结肠癌细胞增殖的实验研究

目的：研究外源性生长激素（GH）和生长抑素（SS）对人结肠癌细胞株HT-29的影响，并探讨其作用机制。方法：人结肠癌细胞株HT-29分成正常对照组、生长抑素组（SS组）、生长激素组（GH组）和生长抑素＋生长激素组（GH＋SS组）。MTT法测定细胞抑制率，流式细胞仪测定细胞周期分布、增殖指数、凋亡率，RT—PCR方法测定bcl．2及baxmRNA水平。结果：生长抑素能够明显抑制人结肠癌细胞株HT-29增殖（P〈0．01）、降低S期和G2／M期细胞比例（P〈0．05）、降低增殖指数（PI）（P〈0．05）、促进细胞凋亡（P〈0．01）、降低bcl-2mRNA表达（P〈0．05）、提高baxmRNA表达（P〈0．01），生长激素则无明显作用。GH＋SS组表现与SS组相似。结论：生长抑素可能通过抑制GdG．期细胞进入S期和G2／M期以及促进细胞凋亡两种途径抑制体外培养的人结肠癌细胞株HT-29增殖。生长抑素可能是通过改变bax基因和bcl-2基因的表达影响肿瘤细胞的凋亡。生长激素对体外培养的人结肠癌细胞株HT-29无显著影响。     

VEGF-C干扰对结肠癌血管和淋巴管影响的实验研究

目的 探讨人结肠癌BALB／c裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射携带VEGF—C小分子干扰RNA（siRNA）的腺病毒载体对VEGF—C表达、肿瘤生长及淋巴管生成的影响。方法裸鼠皮下注射Lovo细胞构建人结肠癌皮下移植瘤模型24只,随机分为4组,每组6只,以腺病毒、空病毒、裸siRNA及PBS分别进行瘤内原位注射干预．计算肿瘤体积变化．检测瘤内淋巴管和血管生成情况。结果与其他3组相比．腺病毒组肿瘤生长受到明显抑制（P〈0．05）。腺病毒组微血管密度（MVD）值为22．65±6．04,与其他3组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;腺病毒组微淋巴管密度（LVD）值为8．47±2．1,明显低于其他3组（P〈0．05）。结论瘤内注射携带VEGF—C siRNA的腺病毒载体可抑制人结肠癌裸鼠移植瘤模型中肿瘤的生长和淋巴管生成．而对肿瘤血管生长无明显影响。     

塞来昔布对人结肠癌细胞生长及裸鼠肝转移瘤形成的影响

目的探讨塞来昔布对体外培养的结肠癌细胞生长及裸鼠肝转移瘤的影响。方法以人结肠癌细胞株HT-29（COX-2高表达）和HCT-116（COX-2低表达）为研究对象，采用噻唑蓝（MTT）比色法检测塞来昔布对2种细胞的增殖抑制效应，应用流式细胞术检测2种细胞的周期分布情况；将2种细胞接种裸鼠，观察其肝转移瘤形成情况。结果①塞来昔布对人结肠癌细胞株生长的抑制作用呈时间、剂量依赖性效应（P〈0．05，P〈0．01），且对HT-29细胞的作用强于HCT-116细胞（P〈0．05）。②塞来昔布可改变结肠癌细胞株细胞周期的分布，明显降低其增殖指数。③塞来昔布具有明显的抑制裸鼠肝转移瘤生长的作用。结论塞来昔布可能通过抑制COX-2酶活性而抑制结肠癌细胞的分裂和增殖，诱导其凋亡，干预结肠癌的转移与复发。     

PLK1 及 STK15 基因在结肠癌细胞中的表达及其特异性抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响

目的 研究保罗样激酶1（polo-like kinase 1,PLK1）及丝氨酸/苏氨酸激酶15（serine/threonine kinase15,STK15）mRNA及其蛋白在结肠癌细胞中的表达,以及其特异性抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响。方法 选取人宫颈癌Hela细胞和人结肠癌HCT-116细胞、HT-29细胞及CACO-2细胞,以β-actin为内参照,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测PLK1 mRNA和STK15 mRNA的表达水平;采用Western blot法检测PLK1蛋白和STK15蛋白的表达水平;采用偶氮唑盐（MTT）法检测Dulbecco改良细胞培养基（DMEM培养基）、二甲基亚砜（DMSO）、SBE13（PLK1蛋白特异性抑制剂） 或VX-680 （STK15蛋白特异性抑制剂） 处理后4种癌细胞的增殖活性。结果 与Hela细胞比较,HCT-116细胞、HT-29细胞及CACO-2细胞的PLK1和STK15 mRNA及其蛋白的表达水平均较高（P＜0.05）。① Hela细胞：与DMEM组比较,SBE13组、VX-680组及SBE13＋VX-680组的增殖能力无明显变化（P＞0.05）。② HCT-116细胞和HT-29细胞：与DMEM组比较,VX-680组和SBE13＋VX-680组的增殖能力均降低（P＜0.05）,但SBE13组的差异无统计学意义（P＞0.05）。③ CACO-2细胞：与DMEM组比较,SBE13组、VX-680组及SBE13＋VX-680组的增殖能力均降低（P＜0.05）。结论 HCT-116、HT-29及CACO-2结肠癌细胞的PLK1 mRNA和STK15 mRNA及其蛋白的表达水平均高于Hela细胞,应用其特异性抑制剂可抑制部分结肠癌细胞系的生长。     

人结肠癌相关成纤维细胞对结肠癌Lovo细胞生物学行为的影响

目的探讨人结肠癌相关成纤维细胞（CAF）对结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法收集人结肠CAF及正常成纤维细胞（NF）条件培养基,建立结肠CAF、NF与Lovo细胞间的共培养模型,以无血清培养基处理的Lovo细胞作为空白组．进行细胞增殖、黏附、迁移及Transwell侵袭能力检测。结果Lovo细胞与结肠CAF共培养后。增殖48和72h反映细胞增殖的吸光度（A）值分别为（0．667±0．059）和（0．709±0．030）,明显高于空白组[（0．574±0．031）和（0．593±0．031）]和NF组[（0．597±0．036）和（0．652±0．029）],差异均有统计学意义（P〈0．01）;黏附细胞的A值为（0．588±0．067）,也明显高于空白组（0．226±0．039）和NF组（O．375±0．059）,差异也均有统计学意义（P〈O．01）;12h和24h细胞迁移率分别为（35．2±8．7）％和（64．6±7．1）％,明显高于空白组[（14．7±3．6）％和（26．3±10．3）％]和NF组[（14．1±7．3）％和（35．2±9．8）％]（P〈O．01）;透膜细胞数为（56．2±4．8）个,多于空白组的（14．6±2．2）个和NF组的（22．9~4．5）个（P〈O．01）。结论人结肠CAF具有增强结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的能力。     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。     

塞来昔布抑制人结肠癌细胞Caco-2细胞增生的分子机制

目的研究塞来昔布在体外对人结肠癌细胞Caco-2生长增生及其抗肿瘤的相关分子机制。方法体外培养人结肠癌细胞Caco-2,MTY法检测塞来昔布在相同浓度下,不同时间对于结肠癌细胞增生的影响,并计算Ic。值;RT—PCR法检验COX-2、Survivin的mRNA的表达影响。结果MTF结果显示：相同干预浓度塞来昔布抑制人结肠癌细胞增生,其24h,48h,72h的Ic。分别为：（99．519±10．355）μmol／L、（71．546±6．446）μmol／L、（59．622±15．999）μmol／L;RT-PCR结果显示：人结肠癌细胞Caco-2正常对照组及塞来昔布干预组COX-2mRNA灰度值分别为：0．808±0．021、0．101±0．002（t=19．037,P=0．000）;Survivin mRNA灰度值分别为：0．798±0．031、0．190±0．002（t=18．987,P=0．002）。结论塞来昔布抑制结肠癌细胞增生,塞来昔布抗肿瘤机制可能是通过抑制COX-2及Survivin的mRNA的表达来实现的。     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响。方法用不同药物浓度的5-FU处理SW480细胞,用CCK8法检测5-FU在SW480中的IC50,流式细胞仪检测SW480细胞ABCG2的阳性表达率．RT—PCR检测ABCG2的mRNA在SW480细胞中的表达差异。结果5-FU对SW480细胞的IC50随着药物浓度的增加而升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测发现,正常SW480细胞（A组）中ABCG2阳性表达率为（6．26±0．86）％;在药物处理48h后即刻检测时（B组）的阳性表达率下降至（3．43±1．18）％（P〈0．05）;在药物处理48h后的第2代细胞检测时（c组）则升高至（12．91±3．42）％（P〈0.05）。3组ABCG2mRNA表达趋势与流式细胞仪检测结果的趋势一致。结论不同浓度的5-FU可以影响人结肠癌SW480细胞ABCG2的表达。     

法尼酯X受体的激活抑制结肠癌细胞生长

目的 探讨法尼酯X受体（FXR）的激活是否抑制结肠癌细胞的生长。方法 对人结肠癌HCT-116细胞进行体外培养,用四唑氮蓝还原法（MTT）和流式细胞仪测定FXR特异性激动剂GW4064对结肠癌HCT-116细胞生长的抑制作用,同时应用RT-PCR方法检测其FXR mRNA及VEGF mRNA的表达。结果 FXR特异性激动剂GW4064可上调结肠癌HCT-116细胞的FXR mRNA表达,下调VEGF mRNA的表达; 对结肠癌HCT-116细胞的生长具有明显的抑制作用,并促进结肠癌HCT116细胞的凋亡,且均呈剂量及时间依赖关系。结论 FXR特异性激动剂GW4064可以显著抑制结肠癌HCT116细胞的生长,激活FXR受体可能为结肠癌的治疗提供一种潜在的靶点。     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。