顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验

【目的】研究顺铂（DDP）、洛铂（LBP）、紫杉醇（PTX）、吉西他滨（GEM）对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3/DDP细胞增殖的影响。【方法】培养基中不含药物的处理组为对照组,加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。在相差显微镜下观察细胞形态变化;用MTT法测定单药应用、双药联合使用对两种细胞生长的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率的变化。【结果】SKOV3∕DDP细胞耐药指数为7.10±2.19。紫杉醇、洛铂、吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。洛铂、紫杉醇、吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比,能显著抑制肿瘤细胞的生长,其中吉西他滨＋洛铂及紫杉醇＋洛铂组抑制率明显增高。相同浓度顺铂作用48h后,SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。洛铂、紫杉醇、吉西他滨作用两种细胞48h后,细胞凋亡率差异无统计学意义。顺铂、洛铂与紫杉醇、吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。【结论】SKOV3/DDP细胞对紫杉醇、洛铂、吉西他滨无交叉耐药。联合用药有高效协同抑制细胞生长作用,临床治疗卵巢癌顺铂耐药患者可考虑选择吉西他滨＋洛铂、紫杉醇＋洛铂联合化疗。     

顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验

【目的】 研究顺铂(DDP)。洛铂(LBP)。紫杉醇(PTX)。吉西他滨(GEM)对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3 /DDP细胞增殖的影响。【方法】 培养基中不含药物的处理组为对照组,加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。在相差显微镜下观察细胞形态变化;用MTT法测定单药应用。双药联合使用对两种细胞生长的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率的变化。【结果】 SKOV3∕DDP细胞耐药指数为7.10 ± 2.19。紫杉醇。洛铂。吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。洛铂。紫杉醇。吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比,能显著抑制肿瘤细胞的生长,其中吉西他滨 + 洛铂及紫杉醇 + 洛铂组抑制率明显增高。相同浓度顺铂作用48 h后,SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。洛铂。紫杉醇。吉西他滨作用两种细胞48 h后,细胞凋亡率差异无统计学意义。顺铂。洛铂与紫杉醇。吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。【结论】 SKOV3/DDP细胞对紫杉醇。洛铂。吉西他滨无交叉耐药。联合用药有高效协同抑制细胞生长作用,临床治疗卵巢癌顺铂耐药患者可考虑选择吉西他滨 + 洛铂。紫杉醇 + 洛铂联合化疗。     

卵巢癌顺铂耐药机制的研究进展

卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一,近几年卵巢癌的发病率有增高的趋势,据报道,美国2007年有22430例卵巢癌新发病例。由于卵巢癌发病隐匿和缺乏完善的早期诊断方法,约70％患者确诊时已为晚期（FIGO分期,Ⅲ期和Ⅳ期）,其死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。在细胞减灭术的基础上施以以顺铂为主的联合化疗方案已成为卵巢癌的常规治疗方案。但由于卵巢癌患者对顺铂的原发性（primary drug resistance）和（或）获得性（acquired resistance）多药耐药（multiple drug resistance,MDR）的存在,     

卵巢癌对顺铂耐药分子机制的研究进展

化疗是治疗卵巢癌的重要手段之一,对化疗药物的耐药是降低晚期卵巢癌患者治愈率的主要原因。顺铂是卵巢癌化疗的一线药物之一,大多数卵巢癌患者起初对顺铂敏感,但是最终常发展为耐药。     

Gleevec诱导顺铂耐药卵巢癌细胞COC1凋亡的形态学研究

目的探讨Gleevec对顺铂耐药卵巢癌细胞COC1的诱导凋亡作用。方法用Gleevec处理COC1细胞,采用MTT法检测Gleevec联合顺铂对细胞增殖的影响。HE染色显微镜下观察细胞,电镜下观察细胞形态学的变化。结果Gleevec显著提高了COC1／DDP对顺铂的敏感性（P〈0．05）;2．5～10μg／ml顺铂与1．0μmol／L Gleevec合用表现为协同作用,2．5～10μg／ml顺铂与2．5～10μmol／L Gleevec合用表现为相加作用。在Gleevec的作用下COC1细胞呈现明显的凋亡改变,形成凋亡小体。结论Gleevec能够诱导顺铂耐药卵巢癌细胞COC1的凋亡。     

miR-181a在卵巢癌细胞中对顺铂的耐药作用

目的探讨miR-181a在卵巢癌化疗抵抗方面的影响及其机制。方法 qRT-PCR检测卵巢癌细胞A2780及A2780/DDP中miR-181a的表达;对A2780及A2780/DDP细胞分别进行miR-181a mimics和inhibitors的转染,并利用qRT-PCR技术验证;MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性,利用TargetScan、miRDB与miRwalk 3个MicroRNA靶基因数据库预测miR-181a下游靶点,并通过Western blot技术分析预测基因的表达。结果与A2780细胞相比,miR-181a在A2780/DDP细胞中的表达明显减弱(P <0.05)。干扰miR-181a表达后,A2780细胞对顺铂的抵抗作用减弱(P <0.05),而上调miR-181a表达,A2780/DDP细胞对顺铂的抵抗作用增强(P <0.05)。通过TargetScan、miRDB、miRwalk三个数据库预测到PRKCD可作为miR-181a下游靶基因,下调miR-181a表达可使PRKCD蛋白表达明显增强(P <0.05);反之,上调miR-18...     

切除修复交叉互补基因表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨卵巢癌细胞系COC1、COC1/DDP、A2780、A2780/DDP中切除修复交叉互补基因(ERCC1)表达与顺铂耐药的关系.方法:采用RT-PCR方法检测4种卵巢癌细胞系中ERCC1基因的表达,MTT检测各细胞系对顺铂的敏感性.结果:4种细胞系中均有ERCC1基因表达,耐药细胞中的表达量明显高于敏感细胞(P＜0.05).DDP作用于COC1、COC1/DDP细胞72小时后,随着ERCC1基因表达的升高,细胞对顺铂的耐药性增加.结论:卵巢上皮性癌细胞系中ERCC1基因表达的升高与卵巢癌顺铂耐药相关.     

肺耐药蛋白与卵巢癌顺铂耐药表型的相关性

目的探讨肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP）与人卵巢癌顺铂耐药细胞A2780／DDP顺铂耐药表型的关系及其分子机制。方法应用Lipofectamine^TM介导反义寡核苷酸（AsODN）体外转染人卵巢癌细胞；采用RT-PCR和Western blot法检测转染前后细胞中LRP基因的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测顺铂对转染前后细胞的杀伤效应；通过高效液相色谱仪（HPLC）检测经LRP AsODN或抗LRP单克隆抗体作用后，顺铂在A2780／DDP细胞质、核中的吸收和排泄情况。结果与非耐药亲本细胞A2780相比，A2780／DDP细胞内LRP表达明显增高。LRP AsODN能明显降低A2780／DDP细胞中LRP表达水平，逆转其顺铂耐药表型。经LRP AsODN或抗-LRP单克隆抗体作用后，A2780／DDP细胞中顺铂含量明显增高，尤以胞核中的含量上升为甚，而其从核中的排泄受到显著性抑制。结论LRP可能参与介导人卵巢癌细胞顺铂耐药表型的产生，并可能与顺铂在卵巢癌细胞胞质囊泡以及细胞核质交换中的代谢过程密切相关。     

香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制

目的:研究香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制。方法:根据药物处理方法将A2780卵巢癌细胞分为CON组(未行香菇多糖或顺铂处理)、DDP组(仅用顺铂处理)、LEN组(仅用香菇多糖处理)及D+L组(香菇多糖联合顺铂处理),比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因mRNA表达的差异。结果:D+L组细胞第1-7天的吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05),G0/G1期和细胞凋亡率均显著高于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05);LEN组和D+L组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05),CON组和DDP组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达显著高于LEN组和D+L组细胞(均P<0.05)。结论:香菇多糖体外可逆转卵巢癌细胞对顺铂耐药性,可能与降低MDR1和MRP1表达有关。     

卵巢癌顺铂耐药细胞系建立及部分耐药基因的表达

目的建立卵巢癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞系,并比较耐药与非耐药卵巢癌细胞系之间部分耐药相关基因的表达差异。方法采用浓度梯度递增法建立人卵巢癌DDP耐药细胞系SKOV-3/DDP。验证其有关的生物学指标;并用免疫组化法及RT-PCR技术检测耐药与非耐药卵巢癌细胞系之间P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及部分耐药相关基因的表达差异。结果耐药细胞系对DDP、氟尿嘧啶(fluorouracil)和多柔比星(doxorubicin)的耐药指数(RI)分别为13.94、10.83、4.52;细胞周期比例SKOV-3/DDP细胞系G0/G1期细胞明显少于SKOV-3细胞系(P<0.01),S期、G2/M期细胞明显多于SKOV-3细胞系(P<0.01);P-糖蛋白(P-gp)阳性细胞率SKOV-3/DDP细胞系为65%±5%;SKOV-3细胞系为6%±2%,两者差异极显著(P<0.001)。在检测的耐药相关基因中MDR1、Sur-vivin在SKOV-3/DDP细胞系呈阳性表达,在SKOV-3细胞系未表达;TopoⅡβ表达情况与此相反。结论顺铂诱导的卵巢癌细胞耐药可对其他不同作用机制的药物产生交叉耐药,多药耐药涉及多个相关基因的表达,说明耐药的发生是一个多途径的复杂过程。     

紫杉醇对顺铂耐药卵巢癌细胞的影响

目的研究抗癌药物诱导顺铂耐药细胞的调亡的规律,为卵巢癌的化疗提供理论依据。方法紫杉醇作用于体外培养的顺铂耐药的卵巢癌细胞COC1细胞系通过HE染色、电子显微镜、流式细胞术等方法进行检测和观察。结果经紫杉醇处理的卵巢癌COC1细胞出现典型的细胞调亡特征。紫杉醇诱导细胞调亡在一定范围内具有剂量依赖性,最高达到39%,但是浓度加大〉50nmol/ml,调亡率下降。结论紫杉醇能有下得诱导顺铂耐药的肿瘤细胞的调亡。     

雌激素影响卵巢癌细胞系COC1顺铂耐药的相关机制

目的研究雌激素对顺铂诱导卵巢癌细胞系COC1和COC1／DDP凋亡的影响。方法运用细胞培养、MTT、原位标记法、流式细胞术和免疫组化等方法，采取雌激素预先作用卵巢癌COC1和COC1／DDP细胞16h，随后与顺铂共同培养诱导凋亡方式，动态地观察雌激素对顺铂诱导这两个细胞系凋亡影响和此过程中细胞周期分布和p53蛋白表达的改变。结果雌激素促进顺铂诱导的COC1和COC1／DDP细胞凋亡．引起细胞周期由G2到S期的转变，p53蛋白对雌激素作用无明显影响。结论处于细胞周期顺铂不敏感期的卵巢癌细胞可能与其耐药有关，雌激素可增加耐药的COC1／DDP细胞顺铂敏感性。     

bcl-2-反义寡核苷酸对卵巢癌顺铂耐药细胞株的耐药逆转作用

目的：探讨bcl-2—反义寡核苷酸(bck-2—AODN)对卵巢癌顺铂(DDP)耐药细胞耐药性的逆转作用。方法：以卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP为模型,用脂质体转染的方法,将bck-2-AODN转染A2780/DDP细胞,同时以转染bcl-2正义链(bcl-2-SODN)作对照。采用DNA凝胶电泳检测转染后是否诱导细胞出现凋亡,应用免疫组织化学技术检测Bcl—2蛋白表达变化,RL-PCR检测Bcl—2mRNA表达水平的变化。MTT法检测细胞抑制率与药物半数抑制浓度。结果：脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸12h后,倒置显微镜下即可见A2780/DDP有40％细胞出现变化,收集细胞检测,bcl-2蛋白表达降低;实验组bcl—2mRNA表达水平与转染前相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达率下降(P＜0．05);DNA凝胶电泳出现梯带状条带;细胞药物半数抑制浓度下降(P＜0．05)。结论：bcl-2-AODN可通过增加细胞的凋亡而一定程度地逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性,提高卵巢癌细胞对化学治疗药物的敏感性。     

IL-17A促进卵巢癌顺铂耐药的体外机制探讨

目的:探究IL-17A促进卵巢癌顺铂（DDP）耐药的体外机制。方法:应用流式细胞术分析外源性rhIL-17A对DDP诱导的A2780（顺铂敏感卵巢癌细胞株）和OVCAR3（顺铂耐药卵巢癌细胞株）细胞的凋亡和周期分布变化的影响,并以IL-17RAmAb进行相应的阻断实验。结果:rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞的凋亡无显著影响;但可显著降低DDP对A2780和OVCAR3细胞的毒性作用（P<0.05）,以IL-17RAmAb进行阻断实验可部分消除rhIL-17A对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡的阻滞作用（P<0.05）。rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞的周期分布无显著影响;但可显著抑制 DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞周期阻滞（P <0.05）,使A2780和OVCAR3细胞的G0/G1期比例增加,G2+S期比例减少。结论: IL-17A可通过IL-17RA抑制DDP诱导的卵巢癌细胞凋亡,同时可抑制DDP诱导的卵巢癌细胞周期阻滞,从而加剧以DDP为基础的卵巢癌化疗耐药性。     

水通道蛋白1的表达对卵巢癌细胞C13K顺铂耐药影响的体外研究

目的研究水通道蛋白1（aquaporin1,AQP1）在卵巢癌耐药细胞株C13K化疗耐药中作用。方法构建AQP1正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌耐药细胞株C13K,实时聚合酶链反应（real—timepolymerasechainreaction,RT-PCR）及蛋白质免疫印迹法（Westernblot）分析AQP1的表达;CCK-8细胞毒性试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果①转染AQP1真核表达载体的细胞经顺铂作用后细胞凋亡率高于转染空载体和未转染的细胞;②转染AQP1真核表达载体细胞相对于转染空载体和未转染的细胞对顺铂敏感性更高。结论上调AQP1表达,可一定程度逆转卵巢癌耐药细胞株C13K对顺铂的耐药。     

脂质体莪术醇逆转卵巢癌顺铂耐药作用的机制

目的 研究脂质体莪术醇(LC)对人卵巢癌细胞顺铂耐药的逆转作用及其机制。方法 采用卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP,细胞分为5组：空白对照组、阴性对照组(含12.5μg/ml脂质体)、顺铂组(4μg/ml)、LC组(20μg/ml)、联合组[顺铂(4μg/ml)+LC(20μg/ml)],CCK-8检测各组细胞增殖能力,高效液相色谱-串联质谱法检测细胞内顺铂平均含量,流式细胞术检测细胞凋亡,qRT-PCR检测P糖蛋白(P-gp)的mRNA相对表达量,免疫细胞化学和Western blot检测各组细胞P-gp蛋白的表达情况。结果 联合组细胞增殖能力最低,凋亡率最高(P<0.05);联合组细胞内顺铂平均含量大于顺铂组(P<0.05);联合组细胞的P-gp mRNA和蛋白相对表达量低于单用顺铂组(P<0.05)。结论 LC可通过抑制P-gp的表达,降低人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP对顺铂的耐药性。     

下调转化生长因子β活化激酶1的表达逆转卵巢癌细胞顺铂耐药

目的 探究转化生长因子β活化激酶1(TAK1)对卵巢癌顺铂耐药的影响及作用机制。方法 体外培养人卵巢癌细胞SK-OV-3和SW626,转染对照shRNA或shTAK1质粒,经不同浓度顺铂(0～32μg/mL)处理24 h,用CCK-8法检测细胞活力,用AnnexinⅤ/7-AAD染色法检测细胞凋亡水平;建立顺铂耐药SK-OV-3/DDP细胞,经不同浓度顺铂(0～32μg/mL)处理24 h,用CCK-8法检测细胞活力;顺铂耐药细胞转染对照shRNA和shTAK1质粒,用蛋白质免疫印迹实验检测TAK1、选择性自噬接头蛋白p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达,用免疫荧光染色法检测LC3定位;用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)处理耐药细胞,检测细胞活力。结果 与转染对照shRNA的细胞相比,转染shTAK1的细胞在不同顺铂浓度下的细胞活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡水平显著升高(均P<0.05);与SK-OV-3细胞相比,SK-OV-3/DDP细胞p62、LC3-Ⅱ表达水平显著升高(均P<0.05),LC3聚集体形式增加;用3...     

内质网应激反应与人卵巢癌细胞顺铂耐药性关系的实验研究

目的:探讨顺铂敏感的人卵巢癌SKOV3细胞与顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞之间内质网应激的差异及其与顺铂敏感性的关系。方法:采用人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞,给予顺铂进行体外实验。Hochest33342染色,激光共聚焦显微镜观察细胞核形态。免疫荧光结合免疫印迹技术检测内质网应激标志蛋白Grp78和PDI的表达。用钙离子敏感的荧光探针Flour-4/AM和Rhod-2/AM分别检测人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞浆和线粒体钙离子含量变化。结果:MTT法检测人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞生存率,两种细胞对顺铂的敏感性存在明显差异,SKOV3细胞对顺铂敏感性显著高于SKOV3/DDP细胞;Hochest33342染色结果显示顺铂(6μg/ml)作用24h,可以引起SKOV3细胞发生明显的凋亡,而SKOV3/DDP细胞无明显变化;顺铂作用SKOV3细胞,导致Grp78和PDI的表达明显增加,内质网应激介导的凋亡信号分子CHOP、Caspase-4表达增加,线粒体Cyt C的释放以及Caspase-3的活化增加,而SKOV3/DDP细胞无明显变化;顺铂作用于SKOV3细胞,引起胞浆和线粒体钙离子含量的显著增加,而SKOV3/DDP细胞无显著变化。结论:顺铂敏感性不同的人卵巢癌细胞,其在顺铂作用下的内质网应激反应存在显著差异,顺铂敏感的细胞其内质网应激强度高,并且其在顺铂作用后的胞浆和线粒体钙离子明显升高,内质网应激途径和线粒体途径凋亡被激活,这些结果表明卵巢癌顺铂耐药可能与内质网应激耐受有关。