人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor 1 alpha,HIF-1α)腺病毒表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础.方法 采用分子克隆技术,以Kpn Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切pcDNA3.1( )-HIF1α质粒获得HIF-1α cDNA,克隆到质粒pEGFP-C1,以Nhe Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切得到EGFP-HIF-1α cDNA,重组到穿梭质粒pShuttle2,再以PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切重组穿梭质粒,获得含有EGFP-HIF-1α cDNA的表达盒,与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-EGFP-HIF-1α腺病毒质粒,脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察结果,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-EGFP-HIF-1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定.结果 经酶切鉴定及PCR证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109nfu/ml.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α,为冠心病的HIF-1α基因治疗研究奠定更直观的基础.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

人脂联素基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含有人脂联素基因apM1的重组腺病毒载体,制备能表达人脂联素蛋白的重组腺病毒,为脂联素用于体内外干预动脉粥样硬化奠定基础.方法:自质粒pGEM-T-apM1上扩增两端带有Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的全长apM1基因,将PCR产物和穿梭质粒pShuttle-CMV经Sal Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,连接、转化、筛选,进行PCR鉴定后送双向测序.将鉴定正确的重组质粒pShuale-CMV-apM1用Pme Ⅰ酶切使其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转BJ5183菌,进行细菌内同源重组,筛选、鉴定、扩增,Pac Ⅰ酶切后用LipoefctaminTM2000转染低代数的HEK293包装细胞,进行包装出毒.结果:重组穿梭质粒pShuttle-CMV-apM1经PCR和测序鉴定正确,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,转染293细胞进行包装,产生的病毒经鉴定正确,并且无具有复制能力的腺病毒存在,生物安全性高.结论:成功的制备了apM1基因重组腺病毒,可进一步用于脂联素干预动脉粥样硬化的研究.     

人PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的重组腺病毒载体。方法从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中提取并扩增人PPARγcDNA目的片段,将该目的片段经AgeⅠ/NheⅠ酶切后插入经相同内切酶酶切后表达质粒(CMV-MCS-SV40-EGFP)得到重组穿梭质粒;再将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHG loxΔE1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建重组腺病毒(Ad-PPARγ);最后,将Ad-PPARγ感染HEK293T细胞,进行病毒的包装、扩增、纯化及滴度检测。结果通过PCR鉴定及基因测序分析,PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功;Western blot结果显示经包装及纯化的Ad-PPARγ感染HUVECs后,可显著上调HUVECs中PPARγ基因的表达。结论PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功,且能有效上调HUVECs中PPARγ基因的表达。     

人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人双突变型HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒表达载体,研究人双突变型低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用.方法 在业已完成的pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上,用PCR定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-lα-Ala402-Ala564,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒连接,重组成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为重组Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒.结果 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564(双突变型),为冠心病的突变型HIF-1α基因治疗研究奠定基础.     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的 研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用Lipofectamine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性.结果 经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致.LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中.结论 实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达.     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

重组AdPD-L1腺病毒的构建表达及鉴定

目的构建程序性死亡配体-1(PD-L1)重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pcDNA3.1/PD-L1质粒,亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细胞内和AdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.PCR、Western blot鉴定AdPD-L1感染293细胞后PD-L1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测和PD-L1在混合淋巴细胞反应中的作用.结果测序、酶切证实PD-L1基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR、Western blot检测AdPD-L1感染的293细胞,均有PD-L1的表达.无野生型腺病毒的产生,PD-L1能显著抑制小鼠混合淋巴增殖反应.结论成功构建了含小鼠PD-L1基因的重组腺病毒载体,这种膜结合性的PD-L1与其相应受体结合后,对T细胞可起到负性调控的作用,为下一步体内基因治疗实验奠定了基础.     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

SHP-1基因重组腺病毒的构建与表达

目的 构建并鉴定人蛋白酪氨酸磷酸酶基因(SHP-1)重组腺病毒Ad-SHP1.方法 将人SHP-1 cDNA克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得带有SHP-1基因的重组腺病毒质粒pAd-SHP1,经PacⅠ线性化后通过Lipofectamine2000转染HEK293包装细胞,观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况.收获重组腺病毒,经PCR和Western Blotting鉴定后,扩增并纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.结果 经测序、酶切电泳和感染后蛋白表达检测均表明成功构建重组腺病毒Ad-SHP1;病毒滴度为1.58×1010 pfu/mL.结论 成功构建带有人SHP-1 cDNA的重组腺病毒,为进一步研究结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生机制及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。