新型聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨的细胞相容性

目的前期试验证实,当纳米羟基磷灰石含量为20%时的聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料能满足人体骨缺损修复的生物力学要求,尚需进一步的观察其细胞相容性,为临床应用提供参考数据。方法制备纳米羟基磷灰石含量为20%时的聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料,并提取浸提液。设立阴性对照组(含10%胎牛血清的DMEM完全培养基)、实验组(浸提液)、阳性对照组(质量浓度为0.64%的苯酚),用兔骨髓间充质干细胞与材料浸提液共培养的方式进行。观察兔骨髓间充质干细胞在培养3,5,7 d各时相点的细胞形态学变化,运用MTT比色法,测定上述各组兔骨髓间充质干细胞细胞培养3,5,7 d的相对增殖度,判断材料对细胞的毒性程度。结果随着时间的延长,3组细胞的吸光度值均明显增加(P<0.01)。实验组兔骨髓间充质干细胞相对增殖度在第3,5,7天分别为95.3%,96.8%和97.6%,参照国家标准聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料的细胞毒性为1级;实验组与阴性对照组比较差异不显著(P>0.05),阳性对照组与其他两组比较差异显著(P<0.05)。实验组细胞形态正常,呈梭形,贴壁生长良好。结论聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨材料细胞相容性良好,细胞毒性为1级,参照GB/T16886.5.2003标准属于安全范围。     

仿生增强型纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架研究现状

骨组织工程是修复骨缺损最有前途的方法,寻找理想的支架材料是目前骨组织工程研究的热点之一。近年来采用仿生学原理制备的增强型纳米羟基磷灰石聚乳酸复合支架材料因具有良好的生物相容性和生物降解性而广泛研究。该文就纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架材料的制备、力学性能及影响因素、与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化骨、与骨形态发生蛋白复合构建活性人工骨的成骨性能研究现状作一简要综述。     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究

目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞,按照经典组织工程构建方法,分别接种双相磷酸钙（对照组）和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石（实验组）支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况;MTT法检测细胞增殖功能;碱性磷酸酶（ALP）检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组,差别有统计学意义（P〈0.01）。结论：新型BCP支架与兔BMSC在体外具有良好的相容性,二者具有体外构建工程骨的潜力。     

无定形磷酸钙负载rhBMP-2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验

[目的]制备无定形磷酸钙（ACP）负载重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2／ACP）纳米缓释体并观察其细胞毒性，为进一步体内植入提供实验依据。[方法]采用湿化学法合成rhBMP-2／ACP纳米缓释体；兔间充质干细胞（BMSCs）与rhBMP-2／ACP纳米缓释体进行体外复合培养，观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达，检测材料的细胞毒性。[结果]材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响，其细胞相对增殖率在100．2％～102．5％之间，细胞毒性评级为0级；BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。[结论]rhBMP-2／ACP纳米缓释体无细胞毒性，复合培养不影响BMSCs的正常生理功能，细胞相容性良好。     

四种不同载体材料体外生物相容性比较

目的 以4种不同载体材料和骨髓基质干细胞(BMSC)复合培养,观察不同载体材料的体外生物相容性.方法 将密度为2×10~5个/ml的BMSC与纳米相羟基磷灰石胶原复合材料(NHAC)、可注射性纳米相羟基磷灰石胶原复合材料(INHAC)、非纳米相羟基磷灰石胶原复合材料(HAC)、珊瑚羟基磷灰石(CHA)体外与BMSC复合培养,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,并行扫描电镜观察,进行形态学和功能测定.结果 细胞活度A值所绘制的生长曲线显示,BMSC的活性未受到NHAC、INHAC、CHA的影响,HAC组随培养时间的延长细胞活性逐渐下降,与其他组比较差异均有统计学意义(P<0.01).碱性磷酸酶活性测定:CHA组为2.207±0.079、NHAC组为2.225±0.059、INHAC组为2.194±0.088、HAC组为0.981±0.210、空白对照组为2.231±0.087,NHAC、INHAC、CHA与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),和HAC组筹异均有统计学意义(P<0.01).扫描电镜观察可见,细胞能在NHAC、INHAC、CHA材料上良好地增殖、生长,而HAC不利于骨髓基质干细胞的黏附、增殖.结论 3种材料具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程骨替代材料,HAC不适合做细胞载体材料.     

纳米组织工程骨与兔骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的探讨纳米组织工程骨(NHAC)与兔骨髓基质干细胞(RMSCs)体外生物相容性,为应用组织工程方法修复骨缺损提供依据。方法将RMSCs与NHAC体外复合培养,进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在纳米组织工程骨上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米组织工程骨的影响。结论NHAC具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的生物材料。     

兔骨髓间充质干细胞在HA/CS支架中的增殖活性

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在羟基磷灰石(HA)/壳聚糖(CS)复合支架材料中的生长和增殖情况,探讨复合材料与细胞的相容性。方法:穿刺法抽取新西兰大耳白兔骨髓3ml,通过密度梯度离心法获取MSCs,体外贴壁培养,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。将第2代细胞以高密度接种到支架材料中体外三维培养,观察其细胞相容性。结果:经密度梯度离心结合贴壁筛选得到纯化的间充质干细胞,细胞能够连续传至9代以上,第2、5代细胞增殖能力最强。细胞进行体外三维培养时,可在HA/CS复合支架材料上良好的附着、生长和增殖。结论:兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养,HA/CS复合支架与MSCs具有良好的细胞相容性。     

TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究

[目的]评价在TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到兔退变椎间盘后是否可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。[方法]采用体外细胞培养技术，将兔骨髓间充质干细胞白骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代、纯化后并在TGF-β1干预下植入兔退变椎间盘的模型中。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化；免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化。所得数据经SPSS 11．5统计学软件进行统计学处理。[结果]原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力，并且8周内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的恢复实验组对比模型组增高明显，统计学显示差异有显著性意义。[结论]将TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到退变椎间盘后可以在一定时间内增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，从而延缓椎间盘退变。     

一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究

[目的]探索胶原／壳聚糖／纳米β-磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。[方法]以Ⅰ型胶原、壳聚糖、纳米β-磷酸三钙（β-TCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外诱导细胞-支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。[结果]材料疏松多孔，孔径大于100μm，孔隙率大于95％。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC-材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。[结论]Ⅰ型胶原／壳聚糖／纳米TCP一体化层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。     

新型钽铌多孔支架材料的细胞生物相容性研究

[目的]研究多孔钽铌(Ta-Nb)材料的细胞相容性。[方法]将兔成骨细胞与多孔钽铌材料共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖、扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达。[结果]CCK-8检测显示实验组多孔钽铌材料上细胞的增殖与空白对照组没有差异性(P﹥0.05);扫描电镜观察到细胞在多孔钽铌的表面和孔隙内大量黏附、增殖和生长,随着共培养时间的增加,材料表面的细胞数量明显增多;RT-PCR显示随着共培养时间的增加,Ⅰ型胶原基因的表达增强(P﹤0.05),骨钙素的表达无明显差异(P﹥0.05)。[结论]多孔钽铌支架材料适于成骨细胞的黏附、生长和分化,具有良好的细胞相容性。     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.     

聚乙烯醇编织构建组织工程前交叉韧带的初步研究

[目的]探讨聚乙烯醇体外编织构建组织工程前交叉韧带支架材料的可行性。[方法]用聚乙烯醇纺丝纤维编织构建韧带支架材料,在电子拉力机上测试该支架材料的力学性质;用组织块和胶原酶消化培养法在体外分离培养人前交叉韧带细胞并对细胞的生长形态和分泌胶原蛋白的特征进行检测,细胞经体外扩增后种植于编织构建的聚乙烯醇韧带支架材料上观察。[结果]韧带支架材料的柔韧性强,拉力测试的负荷—拉伸曲线与韧带的拉伸曲线相似,其最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61 N、14.96 MPa和202.08 MPa;体外分离培养的人前交叉韧带细胞呈典型的成纤维细胞特征,能在体外分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质;支架材料无细胞毒性,人前交叉韧带细胞可在支架材料上黏附、生长并分泌细胞外基质。[结论]支架材料具有一定的力学性能和优良的生物相容性,有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。     

肝素壳聚糖涂层促进脱细胞骨基质材料修复兔阶段性骨缺损血液灌注及血管化的实验研究

[目的]观察复合肝素壳聚糖脱细胞骨基质材料植入骨缺损早期血液供应的变化及血管化的情况.[方法]利用层层自组装方法将带有不同电荷的肝素、壳聚糖聚电解质组装到脱细胞骨基质材料上,通过超微结构及XPS等观察特性并在体外测定抗凝活性.取健康新西兰大白兔30只随机分成6组(1、3、7、14、21、28 d),制作桡骨中段骨缺损模型.一侧植入复合材料,另一侧植入单纯ACBM作为自身对照.在上述时间点行CT灌注成像、组织学等观察.[结果]时间密度曲线显示复合材料呈Ⅱ型,而对照侧呈平滑的Ⅳ型渗透模式;术后1d开始复合材料侧血容量( blood volume BV)、血流量(blood flow BF)显著高于对照侧;术后1～3d组织学观察见复合材料中有大量红细胞和有核细胞,而对照侧以液体为主,偶见细胞;3～7d在复合材料网孔中有血管形成,对照侧在血管材料外周出现且数量显著少于复合材料侧(P＜0.05).[结论]材料表面改性后体内、外均有可控缓释的抗凝效果,桡骨骨缺损植入小体积复合材料后血液呈现灌注模式并加快材料的早期血管化.     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

Allogenic peripheral blood derived mesenchymal stem cells (MSCs) enhance bone regeneration in rabbit ulna critical-sized bone defect model.

Mesenchymal stem cells (MSCs) were demonstrated to exist within peripheral blood (PB) of several mammalian species including human, guinea pig, mice, rat, and rabbit. Whether or not the PB derived MSCs (PBMSCs) could enhance the regeneration of large bone defects have not been reported. In this study, rabbit MSCs were obtained from mononuclear cells (MNCs) cultures of both the PB and bone marrow (BM) origin. The number of PBMSCs was relatively lower, with the colony forming efficiency (CFE) ranging from 1.2 to 13 per million MNCs. Under specific inductive conditions, PBMSCs differentiated into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes, showing multidifferentiation ability similar to BMMSCs. Bilateral 20 mm critical-sized bone defects were created in the ulnae of 12 6-month-old New Zealand white rabbits. The defects were treated with allogenic PBMSCs/Skelite (porous calcium phosphate resorbable substitute), BMMSCs/Skelite, PBMNCs/Skelite, Skelite alone, and left empty for 12 weeks. Bone regeneration was evaluated by serial radiography, peripheral quantitative computed tomography (pQCT), and histological examinations. The X-ray scores and the pQCT total bone mineral density in the PBMSCs/Skelite and BMMSCs/Skelite treated groups were significantly greater than those of the PBMNCs/Skelite and Skelite alone groups ( p < 0.05), respectively. Histologically, newly formed bone was evident in the PBMSCs/Skelite and BMMSCs/Skelite treated groups. The findings demonstrated that the rabbit PBMSCs possessed multidifferentiation potential comparable with BMMSCs, allogenic PBMSCs seeded onto porous calcium phosphate resorbable substitutes enhanced bone regeneration in the rabbit ulna critical-sized bone defect model, suggesting allogenic PBMSCs may be a new source of circulating osteogenic stem cells for bone regeneration and tissue engineering.     

蛇床子素和纳米氧化锆强韧化磷酸钙支架对成骨细胞增殖影响的研究

目的研究蛇床子素与纳米氧化锆强韧化磷酸钙骨支架的相容性，以及其在体外对幼兔成骨细胞增殖和成骨作用的影响。方法酶消化法分离培养幼兔股骨成骨细胞，噻唑兰法(MTT)测量成骨细胞增殖率，用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性。结果蛇床子素对大鼠新生成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著的促进作用，与纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架生物相容性良好。结论纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架复合蛇床子素刺激的成骨细胞，是一种性能良好的复合骨组织工程材料。     

脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

[目的]采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架,为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。[方法]取SD大鼠胸段脊髓约2cm,运用冻融 化学萃取(3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNaseI、RNaseA)的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。[结果]经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分。[结论]本实验采用冻融 化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNa-seI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。     

交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响

[目的]通过对壳聚糖/藻酸盐复合支架材料表面结构、降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能变化的研究,探究交联温度对京尼平交联壳聚糖/藻酸盐组织工程支架的影响.[方法]运用冷冻干燥法制备壳聚糖/藻酸盐支架材料,分别在4℃、25℃、37℃条件,于0.5％京尼平溶液中交联24 h,作为实验组.以未用京尼平交联的支架材料作为对照组,评价支架材料降解率、细胞毒性、孔隙率、含水量以及生物力学性能的特点.[结果](1)伴随交联温度升高,支架材料的颜色从浅紫色变为紫黑色,未交联的支架材料为白色;(2)降解率4周后在4℃为21.54％±3.07％、25℃组为9.9％±1.2％、37℃组为8.98％±0.79％.其中,37℃和25℃组抗降解能力优于4℃组(P＜0.05).各实验组均优于对照组(P＜0.01);(3)弹性模量在4℃组为0.84±0.55,25℃组为1.44±0.06,37℃组为1.53±0.02,对照组为0.79±0.16.对照组与25℃组及37℃组之间差异有统计学 意义(P＜0.05);(4)孔隙率、含水量、细胞毒性各实验组间未见明显差异.[结论]随着交联温度的提高,支架材料的抗降解能力、抗拉伸性能增加,且对支架材料的结构、细胞毒性、孔隙率以及含水量无明显影响.     

转基因骨髓间质干细胞在组织工程承载体中生长及成骨转化的研究

[目的]观察经携带人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染的兔骨髓间质干细胞(MSCs)在以兔脱细胞脱钙骨基质作为组织工程承载体中的生长情况及转基因前后细胞成骨能力的变化。[方法]用携带有人BMP-2基因片段的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染兔骨髓间质干细胞并将其种植在兔脱细胞脱钙骨基质支架中,扫描电镜观察转基因细胞在支架中的黏附生长情况;并通过检测培养上清中的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)含量及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)的分泌量来评估转基因对MSCs成骨能力的影响。[结果]转基因骨髓间质干细胞在组织工程支架中黏附生长良好,转基因组细胞的ALP、BGP含量及Ⅰ型胶原的分泌量与对照组比较差异有显著性意义。[结论]转基因骨髓间质干细胞在兔脱细胞脱钙骨基质支架中能很好的黏附并立体生长,转基因细胞在目的基因所表达的BMP-2蛋白作用下成骨能力明显增强。