抑制性消减杂交筛选疾病相关基因的研究进展

随着人类基因组测序的完成，疾病相关基因的鉴定和克隆将会变得更加快捷和方便。一旦疾病基因的功能被揭示，将会对疾病发病机制产生新的认识。由于基因表达在疾病发展的不同阶段呈现出差异性，这就为我们寻找、鉴定和克隆致病基因提供了一个重要线索。抑制性消减杂交(SSH)就是近年来发展起来的一种有效的分离差异表达基因的方法。     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg激活基因，了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3．1(-)-HBeAg转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为eDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染人肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到40个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～800bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得12种编码基因，包括11种已知基因和1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索，尚需进一步的实验证明。     

应用抑制性消减杂交技术筛选血小板衍生生长因子上调的大鼠肝星状细胞靶基因

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建血小板衍生生长因子（PDGF）-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库,从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制。方法以PDGF-BB刺激的HSC作为实验组,以未用PDGF-BB刺激的HSC作为对照组,分别收获细胞提取总mRNA,并逆转录为cDNA。经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增。将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果成功构建了PDGF-BB刺激HSC差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到93个200～1000 bp的插入片段。挑取含有插入片段的31个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得13种已知基因序列,主要包括电压依赖性阴离子通道、热休克蛋白质47、Ras家族基因RAN等蛋白质基因。结论PDGF- BB作为最有效的促有丝分裂原在激活HSC过程中上调某些与细胞生长相关的蛋白质、参与细胞内代谢的蛋白质及分子伴侣蛋白质等基因的表达,这将为进一步阐明PDGF-BB刺激HSC介导肝纤维化的分子生物学机制提供理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP5的上调基因

目的 通过抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A反式激活蛋白5(NS5ATP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，筛选HCV NS5ATP5蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NSSATP5表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSATP5转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV NSSATP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到91个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中86个均得到100～1000bp插入片段。挑取32个插入片段测序分析。其中包括结缔组织生长因子、纤维连接蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白1等重要的基因。结论 成功筛选出HCV NS5ATP5的上调基因。     

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆NS5A-TP4反式激活相关基因，了解该基因的可能生物学功能。方法：以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3．1(-)-TP4转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照；制备转染后的细胞裂解液，从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RSaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因。结论：应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。     

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV-NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中96个均得到100～1000bp插入片段。挑取40个插入片段测序分析，其中2个cDNA片段为未知序列，通过生物信息学分析获得其全长序列，已被GenBank收录，另有34个为已知功能序列。结论成功筛选出2个新的cDNA序列，并获得其全长序列，可能为HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关靶基因。     

抑制性消减杂交筛选细胞衰老相关基因

目的 研究人胚肺二倍体成纤维细胞2BS在衰老过程中的基因表达变化。方法 对年轻2BS细胞[低于30PD(population doubling)]和衰老2BS细胞(高于55PD)样品进行双向抑制性消减杂交，并筛选分析。结果 构建了2个抑制性消减文库，分别代表年轻细胞和衰老细胞高表达基因，点杂交筛选获得30个差异表达片断(差异比例大于2)包含多种细胞功能的变化。部分差异基因表达在新生儿脐带血和老年人外周血样中差异也有显著性。结论首次报道了RBM4、FBXO7、TOM1等基因在2BS细胞衰老时的表达变化，并表明体外培养细胞与个体的衰老变化过程有一定相似性。     

应用抑制性消减杂交方法克隆人肝细胞癌差异表达基因

Diatchenko等[1]报道了一种新的快速克隆差异表达基因cDNA的方法,称为抑制性消减杂交(SSH),十分适用于克隆造成某种特殊细胞表型的特异表达基因,例如正常和病变之间的基因表达差异分析。人肝细胞癌(HCC)是我国高发的恶性肿瘤之一,其发生发展与多种基因的突变与表达异常有关。我们应用抑制性消减杂交方法克隆HCC与癌旁非癌组织之间差异     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因．方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3．1(-)- DNAPTP1 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建 cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库．文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段．对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列．结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索．     

A method for difference cloning: gene amplification following subtractive hybridization.

We describe a procedure for genomic difference cloning, a method for isolating sequences present in one genomic DNA population ("tester") that is absent in another ("driver"). By subtractive hybridization, a large excess of driver is used to remove sequences common to a biotinylated tester, enriching the "target" sequences that are unique to the tester. After repeated subtractive hybridization cycles, tester is separated from driver by avidin/biotin affinity chromatography, and single-stranded target is amplified by the polymerase chain reaction, rendering it double-stranded and clonable. We model two situations: the gain of sequences that result from infection with a pathogen and the loss of sequences that result from a large hemizygous deletion. We obtain 100- to 700-fold enrichment of target sequences.     

RaSH, a rapid subtraction hybridization approach for identifying and cloning differentially expressed genes

Human melanoma cells growth-arrest irreversibly and terminally differentiate on treatment with a combination of fibroblast interferon and the protein kinase C activator mezerein. This experimental protocol also results in a loss of tumorigenic potential and profound changes in gene expression. Various cloning and cDNA microarray strategies are being used to determine the complete spectrum of gene expression changes underlying these alterations in human melanoma cells. An efficient approach, Rapid Subtraction Hybridization (RaSH), has been developed that is permitting the identification of genes of potential relevance to cancer growth control and terminal cell differentiation. RaSH cDNA libraries are prepared from double-stranded cDNAs that are enzymatically digested into small fragments, ligated to adapters, and PCR amplified followed by incubation of tester and driver PCR fragments. This subtraction hybridization scheme is technically simple and results in the identification of a high proportion of differentially expressed sequences, including known genes and those not described in current DNA databases. The RaSH approach represents an efficient methodology for identifying and cloning genes displaying differential expression that associate with and potentially regulate complex biological processes.     

Molecular cloning of human epsilon-globin gene.

Human beta-like globin genes were investigated by use of rabbit beta-globin cDNA plasmid as a cross-species hybridization probe. Normal and beta 0/delta beta 0 thalassemic DNA were compared by filter hybridization procedures. It proved possible to demonstrate that the rabbit probe detected G gamma, A gamma, delta, beta, beta 0, and delta beta 0 human globin genes as well as an additional unidentified beta-like globin gene. By use of an agarose gel elution procedure, fractions of HindIII-digested DNA enriched for beta-like globin genes were purified. One of these fractions, 8.0 kilobases in size, was clonedinto lambda 788, and EK2 lambda HindIII vector. A positive clone was obtained and characterized by restriction mapping and sequence analysis. The sequence data obtained predicted an amino acid sequence that exactly matches a part of human epsilon-globin. The human non-alpha-globin locus is now nearly complete. delta, beta, and gamma human globin genes have already been cloned and analyzed. We describe here the cloning of the remaining non-alpha-globin gene, epsilon.     

IA-2基因的克隆及原核表达研究

目的 应用基因获取足量且具有免疫活性IA－2重组蛋白,为建立IA－2抗体检测方法奠定基础。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）法从小鼠脑组织RNA中扩增编码IA－2胸内结构域的cDNA,构建表达型重组质粒,以DNA序列分析确证后,在大肠杆菌中表达,用亲和层析纯化融合目的蛋白,并以斑点印迹技术（Dot blot)鉴定其免疫原性。结果 所获特异CR产物正确重组至Pimpoint Xa-1表达载体中。经异丙基硫代半乳糖苷诱导的原核表达及亲和层析得到了纯度较高、相对分子质量约56000的融合目的蛋白,表达量约1mg蛋白／升菌液,且表达产物与谷氨酸脱羧酶抗体阳性的糖尿病患者血清及健康对照血清发生的显色反应差异有显著性（P＜0.05)。结论 原核表达的IA－2融合蛋白具有免疫学活性,可用用于糖尿病患者血清中相关抗体的检测。     

Bcr-abl融合基因片段的克隆及在原核细胞中的融合表达

目的：克隆和表达Bcr-abl融合基因融合位点周围的基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株总RNA作为模板，采用RT-PCR方法扩增包含：Bcr-abl(b3a2)融合位点周围的基因片段。将RT-PCR产物按正确的阅读框架，定向克隆进pGEX-6P-1载体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的下游，将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株，以1．0mmol／L IPTG诱导Bcr-abl融合基因片段的表达。结果：原核细胞融合表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，证实该融合蛋白为42000大小。用该表达产物免疫ICR小鼠，所制备的抗血清可与K562细胞特异性结合。结论：原核细胞表达的p42^Bcr-abl融合蛋白具有p210^Bcr-abl融合蛋白的特异抗原性，为进一步实验研究奠定了基础。