mPEG-CS纳米粒介导livin与survivin小干扰RNA杀伤结肠癌细胞

目的 以mPEG-CS纳米粒作为livin基因和survivin基因的干扰RNA的载体,转染人结肠癌细胞HT-29,观察livin和survivin沉默对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 利用离子交联法,制备粒径约60nm的mPEG-CS纳米粒.利用静电吸附法,以纳米粒混悬液与基因溶液配比为3∶1的条件,构建mPEG-CS-livin shRNA纳米粒、mPEG-CS-survivin shRNA纳米粒以及mPEG-CS-(livin shRNA+surviving shRNA)纳米粒,之后,分别转染进人结肠癌HT-29细胞中.利用RT-PCR和Western Blot分别检测livin、survivin基因和蛋白的表达变化;利用MTT法检测livin、survivin基因表达下调对HT-29细胞增殖的抑制效率;利用Hoechst染色检测livin、survivin基因沉默对HT-29细胞凋亡的诱导.结果 各干扰组均能在mRNA和蛋白水平上有效抑制HT-29细胞中livin、survivin的表达.MTT和Hoechst染色结果显示,联合干扰livin和survivin基因可有效抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,并促进细胞凋亡,且效果均强于单独干扰livin或survivin基因.结论 mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰能有效降低人结肠癌HT-29细胞中livin和survivin基因的表达,抑制HT-29细胞的增殖,并促进HT-29细胞的凋亡,其效果强于单独干扰livin或survivin基因.双基因联合干扰具有协同增强效应.     

肿瘤增殖型腺病毒介导的shRNA干扰结肠癌细胞HT-29 Survivin基因的时效性研究

目的 探讨携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导的RNA干扰对结肠癌细胞HT-29中Survivin基因的时效性.方法 用Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29(以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照),于转染后1 d、7 d、14 d、28 d分别检测其携带的外源性EGFP基因的表达及被转染HT-29细胞中Survivin mRNA和Survivin蛋白的表达.结果 在转染后第7 d,实验各组的外源性EGFP基因均有较高表达,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达被抑制,Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的EGFP基因表达明显高于其他两种载体;在转染后第14 d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用显著下降,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的上述作用仍然很强;转染后28 d,后二者EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用基本消失,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组仍然保持很高的EGFP表达率和RNA干扰效率.结论 Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP介导RNA干扰能长时间高效沉默结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因.     

Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP的构建及鉴定

目的 构建特异性强,转染率高,针对人Survivin进行RNA干扰的肿瘤增殖型腺病毒载体(Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP). 方法将针对人Survivin的shRNA的基因序列及EGFP基因序列克隆至肿瘤增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD;HEK-293细胞中包装出毒得到重组腺病毒Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP并测序鉴定.用重组腺病毒感染结肠癌细胞HT-29并检测转染率,用RT-PCR和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化. 结果序列测定证明针对人Survivin的shRNA序列及EGFP序列被成功构建到肿瘤增殖型腺病毒载体中;Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP对结肠癌细胞HT-29的转染效率显著高于增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P＜0.01);而对肝细胞的转染率则显著低于对结肠癌细胞株HT-29的转染(P＜0.01).与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较,转染Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低(P＜0.01).结论 构建成功携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP,其能选择性地高效转染结肠癌细胞株HT-29并有效干扰Survivin,且较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率.     

高选择性RNA干扰抑制survivin基因对在体结肠癌的治疗作用

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的针对survivin的高选择性RNA干扰对在体结肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响。方法用携带针对人survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KDshRNA/survivin-EGFP转染结肠癌细胞HT-29裸鼠移植瘤模型,以携带相同shRNA的复制缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照,检测移植瘤体变化,以及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率。结果 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰使结肠癌裸鼠移植瘤的瘤体减小、移植瘤细胞凋亡率显著增加,且高于目前常用的复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P<0.05)。结论 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物的制备及其特性研究

目的 制备壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的survivin RNAi基因纳米复合物,并对其相关性质进行评价.方法 通过接枝共聚法制备出空白壳聚糖-聚乙二醇纳米粒;通过静电吸附作用连接基因质粒形成基因纳米复合物.并对基因纳米复合物的包封率进行测定;通过Dnase Ⅰ消化壳聚糖-聚乙二醇纳米-质粒结合物以观察纳米载体对质粒的保护作用;通过对比基因-纳米复合物与裸基因对基因-纳米复合物的转染效率进行评价.结果 经电镜检测表明壳聚糖-聚乙二醇纳米粒呈球形,粒度分布均匀,粒径集中在60 nm左右;琼脂糖凝胶电泳的结果显示纳米粒能有效地保护基因质粒;不同基因纳米比的基因-纳米复合物对质粒的保护作用不同;Dnase Ⅰ消化试验证实壳聚糖纳米载体对质粒DNA有保护作用.结论 制备出的壳聚糖-聚乙二醇纳米粒粒度均匀,并且能有效地连接上质粒并对其有保护作用.壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的survivinKNAi基因纳米复合物克服了KNA干扰在肿瘤的基因治疗中作用短暂和不能持久作用的不足.     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

shRNA沉默Survivin基因对胶质瘤细胞U87生物学行为影响的研究

目的 观察短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默Survivin基因对人脑胶质瘤细胞U87增殖、凋亡等生物学特性的影响.方法 通过脂质体LipofectamineTM 2000对胶质瘤细胞株U87转染Survivin shRNA干扰质粒(Suvrivin shRNA-i),以及对照无意义质粒(Suvrivin shRNA-nonsense),应用RT-PCR、Western blot检测转染前后Survivin mRNA和蛋白表达,流式细胞术测定各组细胞的细胞周期及TUNEL测定细胞凋亡形态.结果 转染Survivin shRNA-i组的Survivin mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.05).与对照组相比较,转染Survivin shRNA-i后细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 靶向Survivin基因的特异性shRNA能够阻制U87细胞的生长并诱导其凋亡.     

载基因壳聚糖-聚乙二醇纳米粒的制备和体外评价

目的 制备壳聚糖-聚乙二醇(CS-PEG)载基因纳米粒,并对其体外的相关性质进行初步研究.方法 用接枝共聚法制备壳聚糖-聚乙二醇纳米粒;用复凝聚法制备载基因纳米粒;通过其形态、粒径、ζ电位、栽药量、包封率和基因保护实验考察其理化特性以及基因转染效果;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法和Western blot法检测转染Mcl-1 siRNA质粒后肝癌细胞中Mcl-1的表达.结果 CS-PEG纳米粒粒径为(68.9±12.3)nm,ζ电位为(32.0±6.4)mV;栽基因纳米粒粒径为(111.4±16.9)nm,ζ电位为(7.5±6.4)mV,包封率为(86.8±9.7)%,载药量为(31.2±5.3)%,对基因有较好的保护作用;载基因纳米粒的最大转染效率为转染后72h的(81.39±3.57)%,强于脂质体组且持续作用时间长(P<0.05);对肝癌细胞中Mcl-1的表达明显抑制.结论 制备出低细胞毒性的CS-PEG纳米载体,载基因后粒径小,带正电荷,有很好的基因保护功能、较高的包封率和栽药量,能高效率转染至细胞并有效抑制肝癌细胞中Mcl-1的表达,降低癌细胞的生存能力.     

壳聚糖纳米基因载体的制备和鉴定

目的 制备载基因壳聚糖纳米粒,研究纳米粒的结构特征以及对细胞的基因转染效率.方法 用表达绿色荧光蛋白的质粒(pGFP)作报告基因,采用复凝聚法制备壳聚糖-pGFP纳米粒.琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖和pDNA的结合能力,通过比色法检测其包封率,用纳米粒度仪和原子力显微镜对纳米粒的形态和粒径分布进行考察;通过荧光显微镜观察壳聚糖纳米粒介导pGFP在体外培养的人结肠腺癌细胞LoVo中的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合,包封率大于90%.制备的壳聚糖-pGFP纳米粒为结构紧密的不规则球形,平均粒径为209 nm,多分散指数为0.15.体外细胞转染的结果表明,壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染LoVo细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白.结论 壳聚糖可以有效凝聚pDNA,采用复凝聚法可制得100～500 nm范围荷正电的纳米粒,有较高的包封率.壳聚糖纳米粒在体外能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,壳聚糖作为非病毒基因载体具有介导核酸类生物大分子的应用价值.     

RhoC-shRNA对结肠癌细胞HT-29细胞生物学行为的影响

目的探讨RhoC-shRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法构建RhoC-shRNA表达载体,以脂质体转染法将之稳定转染入HT-29结肠癌细胞株,Western blot检测转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况,观察转染前后结肠癌细胞周期、凋亡和侵袭能力的变化。结果成功构建RhoC-shRNA真核表达载体,并且转染入结肠癌细胞后,细胞中RhoC蛋白表达水平明显受到抑制,并且抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,降低肿瘤细胞侵袭能力。结论下调RhoC蛋白的表达可抑制结肠癌细胞HT-29的体外增殖和侵袭能力。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。