反义核酸逆转人白血病多药耐药细胞株耐药性的实验研究

据《中华内科杂志》1999年6月38卷第6期报道 为采用一段人工合成的互补于多药耐药基因(mdr_1基因)的反义硫代磷酸寡核苷酸(AS-SODN,反义核酸)转染白血病多药耐药细胞株k562/ADM(耐阿霉素的k562细胞株),来逆转白血病细胞的多药耐药。用四唑     

反义核酸逆转人白血病多药耐药细胞株的耐药性

目的采用一段人工合成的互补于人ｍｄｒ１基因的反义硫代硫酸脱氧寡核苷酸（简称反义核酸）转染白血病多药耐药细胞株Ｋ５６２／ＡＤＭ，来逆转白血病细胞的多药耐药。方法ＭＴＴ法检测Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞对阿霉素的ＩＣ５０，流式细胞仪分析细胞内的柔红霉素含量，免疫细胞化学染色方法确定Ｐ１７０的表达水平，ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍｄｒ１－ｍＲＮＡ的相对水平（ｍｄｒ１／β２－ＭＧ）。结果浓度为２μｍｏｌ的反义核酸使Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞对阿霉素的ＩＣ５０从处理前的２５．７２μｇ／ｍｌ降至处理后的６．９７μｇ／ｍｌ，相对逆转效率为７３．０１％。反义核酸亦使Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内的柔红霉素含量增加，Ｐ１７０表达阳性率从处理前的９８．６％±１．０％降至处理后的１８．３％±０．７％，ｍｄｒ１／β２－ＭＧ下降了０．５，ｍｄｒ１－ｍＲＮＡ相对水平有所下降。结论反义核酸通过下调ｍｄｒ１基因，阻断Ｐ１７０的表达，从而降低Ｋ５６２／ＡＤＭ的耐药性。     

EGCG逆转人耐药肝癌细胞株多药耐药的体内实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)体内逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制.方法:MTT法检测肝癌耐药细胞株BEL-7404/ADR与其亲本细胞BEL-7404耐药倍数,采用BEL-7404/ADR种植于裸鼠皮下,建立肿瘤耐药模型,两周后EGCG灌胃,腹腔注射阿霉素(ADM),联合治疗两周;荧光分光光度法检测瘤体内ADM含量,HE染色观察形态学改变;RT-PCR检测瘤组织mdr1 mRNA的表达,免疫组化法检测瘤组织P糖蛋白(P-gp)的表达.结果:低、中、高EGCG联合ADM组肿瘤生长速度明显低于ADM组,瘤重明显低于阿霉素组;EGCG联合ADM可增加瘤体内ADM的含量 (P<0.01);三个EGCG联合 ADM组与阿霉素组相比HE病理图片显示肿瘤组织纤维包裹,炎细胞浸润; mdr1 mRNA和P-gp的表达明显低于对照组和阿霉素组 (P<0.01).结论:EGCG在体内具有逆转BEL-7404/ADR的耐药作用,机制可能是EGCG下调了肝癌细胞mdr1基因的表达,使P-gp的表达降低,瘤组织内药量增高.     

重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721／ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒（Ad—Asmrp）,在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素（ADM）及柔红霉素（DNR）的半数致死量（IC50）并计算耐药倍数（RF值）;在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P。。表达、并用RT—PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0．487μg／ml、0．328μg／ml,RF值分别为97．4、109．3,RF值分别下降36．8和35．4。在转染后24h,MRPmRNA水平开始下降并呈持续下降趋势（P〈0．01）,48h后伴有P190蛋白表达的持续下降（P〈0．01）,二者趋势一致。转染后48h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升（P〈0．01）。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。     

苦参碱逆转人肝癌细胞株QGY/CDDP多药耐药性的实验研究

目的:探讨中药苦参碱(Mat)对QGY人肝癌细胞及其耐药细胞株QGY/CDDP的细胞生物学作用和可能的耐药逆转作用机制.方法:MIT法检测苦参碱对两细胞的半数抑制浓度(IC50值)并培养Mat作用的QGY/CDDP细胞.比较3组细胞在细胞生长曲线、倍增时间、细胞周期、化疗药物耐药及逆转和细胞内CDDP含量的差别.免疫细胞化学法测定3组细胞P-gP、MRP、Bax蛋白的表达.结果:苦参碱可抑制QGY及其耐药细胞株QGY/CDDP的生长,无交叉耐药性.Mat作用的QGY/CDDP细胞与QGY及其耐药细胞株QGY/CDDP在生物学特性方面表现出一定的差异,细胞的P-gp、MRP、Bax蛋白表达发生变化,降低QGY/CDDP细胞P-gp、MRP蛋白表达,增加了Bax蛋白的表达,增强CDDP对QGY/CDDP细胞的毒性,其逆转耐药倍数为1.9倍.结论:低毒剂量的苦参碱可增强CDDP对QGY/CDDP细胞的毒性,具有部分逆转人肝癌耐药细胞QGY/CDDP的耐药作用.     

索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨索拉非尼体外对人肝癌细胞(BEL-7402/FU)多药耐药性的逆转作用及可能机制.方法 以MTT比色法测定索拉非尼对肝癌细胞的剂量效应曲线,并以流式细胞仪检测索拉非尼对肝癌细胞内罗丹明123 (Rho123)浓度的影响,根据上述实验结果选取合适的索拉非尼实验剂量.以MTT法测定索拉非尼对抗癌药物细胞毒性的影响,用流式细胞仪检测细胞膜转运蛋白(P-gp)的表达,RT-PCR法检测mdr1基因的表达.结果 索拉非尼浓度在4μmol/L时逆转效率较高且毒副作用较小,4 μmol/L的索拉非尼能部分逆转BEL-7402/FU细胞的耐药性,对ADM、5-FU、GEM、DDP的逆转倍数分别为2.98、7.16、1.99、10.08倍,并可部分下调BEL-7402/FU细胞P-gp的表达,使mdrl基因表达与对照组相比下降了27.3%.结论 索拉非尼具有体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用,可能与下调mdr1基因表达、增加细胞内化疗药物的蓄积有关.     

辐射促进多药耐药反义寡脱氧核苷酸体内逆转耐药的实验研究

目的:探讨辐射促转染的多药耐药(MDR)基因mdr;反义寡核苷酸(ASON)体内逆转肿瘤耐药的效果。方法:采用耐药细胞株KBv_(200)移植于裸鼠皮下,建立肿瘤耐药模型,肿瘤局部2Gy~(60)Co-γ辐射后1h,瘤内注射脂质体介导的mdr_1 ASON,经长春新碱联合化疗。结果:对照组与联合辐射组、未联合辐射组肿瘤生长曲线差异有显著性(P<0.01),联合辐射组与未联合辐射组肿瘤生长曲线差异有显著性(P<0.01)。对照组与联合辐射组、未联合辐射组肿瘤体积和肿瘤重量差异有显著性(P<0.01),联合辐射组与未联合辐射组肿瘤体积和肿瘤重量差异有显著性(P<0.01)。联合辐射组肿瘤重量抑制率为(80.78±1.9)%,肿瘤体积抑制率为(84.91±2.1)％。结论:辐射促转染的mdr_1 ASON对肿瘤细胞具有较强的耐药逆转作用。     

川芎嗪逆转肺癌细胞株多药耐药性的研究

目的探讨中药川芎嗪(TMP)逆转肺腺癌SPCA-1细胞株耐药性的作用.方法人肺腺癌SPCA-1细胞株,以阿霉素诱导耐药至终浓度为0.4μg/ml,MTT比色法测定TMP对耐药细胞的耐药性逆转作用.结果100mg/L和320mg/L TMP对细胞的抑制率均小于5%,两者无显著差异.100mg/LTMP加丝裂霉素(MMC)组与相应浓度MMC组比较,细胞抑制率有显著性差异(P＜0.05).加入320mg/L TMP的阿霉素(ADM)、长春地辛(VDS)、MMC组与相应浓度各药物组比较,其细胞抑制率均有显著性差异(P＜0.05),其中1PPC VDS+TMP、1PPC MMC+TMP组与相应药物组比较,差异非常显著(P＜0.01).顺铂(C-DDP)加TMP组与相应浓度C-DDP组比较,细胞抑制率均无显著性差异(P＞0.05).结论无明显细胞毒浓度的TMP可显著逆转SPCA-1人肺腺癌细胞株对ADM、VDS、MMC的耐药性,但对CDDP介导的耐药无影响.     

维拉帕米逆转肺癌细胞株多药耐药性的研究

体外实验研究钙通道阻滞剂维拉帕米对多药耐药性肺癌细胞株SPC—A1／ADM耐药性的逆转作用。结果显示，无细胞毒作用剂量的维拉帕米可逆转SPC－A1／ADM细胞对长春新碱、阿霉素的耐药性，而对顺铂的耐药性无明显影响，该逆转作用有药物浓度依赖性。表明维拉帕米可望作为一种化学增敏剂应用于肺癌的治疗。     

川芎嗪逆转肺癌细胞株多药耐药性的研究

目的探讨中药川芎嗪(TMP)逆转肺腺癌SPCA-1细胞株耐药性的作用.方法人肺腺癌SPCA-1细胞株,以阿霉素诱导耐药至终浓度为0.4μg/ml,MTT比色法测定TMP对耐药细胞的耐药性逆转作用.结果100mg/L和320mg/L TMP对细胞的抑制率均小于5%,两者无显著差异.100mg/LTMP加丝裂霉素(MMC)组与相应浓度MMC组比较,细胞抑制率有显著性差异(P＜0.05).加入320mg/L TMP的阿霉素(ADM)、长春地辛(VDS)、MMC组与相应浓度各药物组比较,其细胞抑制率均有显著性差异(P＜0.05),其中1PPC VDS+TMP、1PPC MMC+TMP组与相应药物组比较,差异非常显著(P＜0.01).顺铂(C-DDP)加TMP组与相应浓度C-DDP组比较,细胞抑制率均无显著性差异(P＞0.05).结论无明显细胞毒浓度的TMP可显著逆转SPCA-1人肺腺癌细胞株对ADM、VDS、MMC的耐药性,但对CDDP介导的耐药无影响.     

BSO逆转人肺腺癌细胞株多药耐药性的实验研究

目的研究谷胱甘肽(GSH)合成酶抑制剂——BSO对人肺腺癌多药耐药细胞株A549DDP细胞内GSH含量影响;探讨BSO逆转多药耐药(MDR)作用机制及逆转效果。方法GSH还原酶循环法测定BSO对细胞内GSH含量的影响。MTT比色法测定经BSO预处理后顺氯氨铂(DDP)、阿霉素(ADM)对细胞50%抑制浓度(IC50)的影响。流式细胞仪检测BSO对MDR细胞内柔红霉素(DNR)荧光强度的影响。结果耐药细胞A549DDP细胞内GSH含量较人肺腺癌A549细胞内GSH含量明显增高。BSO在一定浓度范围内(50～200μmol·L-1)对A549细胞和耐药细胞A549DDP无明显细胞毒性作用(抑制率均小于10%)。BSO呈剂量依赖性非线性抑制细胞内GSH的合成,其对MDR细胞内GSH合成影响较为显著,而对A549细胞内GSH合成影响较小。BSO在一定浓度范围内能降低DDP、ADM对A549DDP细胞的IC50,而对A549细胞的IC50无明显影响。A549DDP细胞内DNR荧光强度较A549细胞显著降低,能不同程度提高A549DDP细胞内柔红霉素荧光强度,均较未处理组显著提高;与未经BSO处理的A549细胞比较,细胞内荧光强度轻度增高,但统计学上无显著性差异。结论BSO能有效逆转A549DDP细胞的MDR,其机制与降低MDR细胞内GSH含量有关。     

黄酮类化合物逆转HeLa细胞株多药耐药性

目的　探讨黄酮类化合物对人类子宫颈癌 He L a细胞多药耐药 (MDR)的逆转作用。　方法　采用WST- 1法鉴定多药耐药亚系 Hvr1 0 0 - 6细胞对抗癌药物长春碱、阿霉素、柔红霉素及 5 -氟尿嘧啶 (5 - Fu)的耐药性 ,观察槲皮素等黄酮类化合物对其耐药的逆转作用 ;采用 RT- PCR法检测联用黄酮类化合物前后 Hvr1 0 0 - 6细胞mdr1 m RNA表达水平。　结果　 Hvr1 0 0 - 6细胞与亲本株 He L a细胞相比 ,对长春碱、阿霉素、柔红霉素均表现出显著耐药性 (P<0 .0 0 1 ) ,耐药倍数分别为 4 96 ,5 2和 1 98倍。加入槲皮素 (1 0μmol/ L )的长春碱、柔红霉素、5 - Fu组与相应浓度单用药物组比较 ,其细胞抑制率差异均有显著性 (P<0 .0 5 ) ,但细胞 m dr1 m RNA表达量在使用槲皮素前后没有变化。　结论　槲皮素对长春碱、柔红霉素、5 - Fu的细胞毒性有增敏作用 ,可逆转 He L a细胞耐药株对部分化疗药物的多药耐药     

RNA干扰逆转肿瘤细胞的多药耐药性

化疗是目前肿瘤治疗的主要措施,而肿瘤多药耐药性（multiresistance,MDR）的产生是肿瘤化疗失败的主要原因。肿瘤MDR机制非常复杂,逆转肿瘤MDR的方法也多种多样,但目前临床上尚未有从根本上完全逆转MDR的理想药物。RNA干扰是最近几年研究逆转MDR的热点,为临床上研制高效、低毒、特异性强的逆转剂提供了前景。     

RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药

目的 筛选高效dsRNA/mdr1,以备研究RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药之用.方法 首先根据siRNA设计原则,以多药耐药基因(mdr1)为靶基因,设计并选择4～5条siRNA/mdr1,经BLAST后体外转录法合成dsRNA/mdr1,用Oligofectamine试剂分别转染HepG2/mdr1,然后从mRNA、蛋白(P-gp)表达水平和细胞功能变化评价HepG2/mdr1耐药性被逆转的程度,比较各个dsRNA/mdr1的逆转效率,筛选出有效的siRNA/mdr1.结果 成功合成5条dsRNA/mdr1(其中1条为阴性对照),dsRNA/mdr1-4 mRNA表达(18.73±1.33)%、蛋白表达变化(79.1±1.6)%～(16.8±0.4)%与其他各组细胞比较,有显著性差异;细胞内柔红霉素(DNR)累积量也较其他组明显增加(平均荧光强度79.58,阳性率84.25%,P＜0.05).结论 体外转录法结合脂质体转染适用于筛选高效siRNA,肯定了siRNA干扰序列能够有效阻抑mdr1基因编码蛋白p170的功能.     

反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药逆转的实验研究

目的　探讨反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法　以mdr1cDNA -9— 6为靶位点 ,合成反义核酸 (ATCCATCCCGACCTC)并用正义链作为对照 (GAGGTCGGGATGGAT) ,通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A5 49/R ,分别采用逆转录聚合酶链反应、流式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察两组细胞的mdr1mRNA、P糖蛋白 (Pgp)表达、罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性。结果　反义核酸处理的细胞mdr1mRNA下降 5 1 2 % ,正义组细胞和对照组细胞无明显变化、反义组细胞Pgp含量明显降低 ,细胞内罗丹明聚集 ,反义组 ,正义组和对照组的阿霉素IC50 分别为 0 0 0 9μg/ml、0 17μg/ml和 0 18μg/ml。 结论　反义核酸具有逆转人肺腺癌多药耐药的作用 ,其作用水平在mRNA或DNA水平 ,使Pgp的表达受到明显抑制 ,对阿霉素的敏感性明显提高。     

川芎嗪逆转人乳腺癌细胞耐药株多药耐药性的实验研究

[目的]观察川芎嗪对抗癌剂诱导人乳腺癌细胞耐药株MCF-7/adr细胞多药耐药性的逆转作用.[方法] MTT法检测抗癌剂对乳腺癌细胞株(MCF-7)和阿霉素诱导的多药耐药细胞株(MCF-7/adr)的半数致死浓度(IC50),计算耐药指数(RI)和加川芎嗪、维拉帕米逆转剂后的逆转倍数;倒置显微镜和荧光显微镜观察川芎嗪逆转后的MCF-7/adr细胞形态;琼脂糖凝胶电泳检测川芎嗪逆转后细胞凋亡的DNA片段.[结果] 对抗癌剂阿霉素、足叶乙甙、长春新碱、紫衫醇和长春花碱,MCF-7/adr细胞株的IC50均有明显增加, RI分别为145.7、41.7、72.2、488.4和286.8;加川芎嗪后IC50均有明显降低,逆转倍数分别为4.6、2.5、6.1、9.2和5.1,与逆转前相比具有统计学意义(P<0.01);荧光显微镜可观察到川芎嗪逆转后细胞凋亡的凋亡小体;琼脂糖凝胶电泳检测出川芎嗪逆转后细胞凋亡的DNA片段.[结论] 川芎嗪有逆转抗癌剂诱导MCF-7/adr细胞的多药耐药性的作用.     

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

P15逆转肝癌多药耐药的机制研究

目的：探讨P15逆转肝癌多药耐药（MDR）的可能机制．方法：①采用顺铂（CCDP）诱导法,建立肝癌HepG2细胞动态MDRHepG2／CDDP细胞模型;②在动态MDRHepG2／CDDP细胞模型中,RT—PCR检测P15mRNA的表达,WesternBlot检测P15蛋白的表达;③建立稳定转染P15正义表达载体的HepG2／CDDP—P15细胞系及转染pcDNA3．1（＋）空载体的HepG：／CDDP—PC对照细胞系;④流式细胞仪检测转染细胞HepG2／CDDP—P15,HepG2／CDDP—PC和亲本HepG2／CDDP的细胞周期及阿霉素（ADR）的蓄积和潴留;⑤WesternBlot检测耐药经典分子MRP-1和P-糖蛋白（P—gP）的表达．结果：HepG2／CDDP动态耐药细胞模型建立成功;P15的mRNA表达水平随着HepG2／CDDP耐药细胞株耐药表型的增强逐渐下降;上调p15基因的表达可显著提高HepG2／CDDP耐药细胞株细胞内ADR的蓄积和潴留,促进G1期细胞阻滞,抑制肿瘤细胞增殖,下调MRP-1,P-gP蛋白的表达．结论：P15与肝癌细胞MDR关系密切,其表达水平随着肝癌耐药细胞株耐药表型的增强而逐渐下降;上调P15的表达,可有效逆转肝癌HepG2／CDDP耐药细胞株的耐药表型．     

纳米微粒介导反义寡脱氧核苷酸逆转乳腺癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨纳米微粒介导耐药基因mdr-1、mrp反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞的影响.方法 采用纳米微粒介导mdr-1、mrp-ASODN转染耐药细胞株MCF-7/ADR,RT-PCR、Western blot检测转染48 h后细胞耐药基因mdr-1、mrp的表达;MTT法检测经转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素(ADR)、表柔比星(epimbicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)和紫杉醇(paditaxel)的敏感性.结果 纳米微粒介导mdr-1、mrpASODN转染48 h后,MCF-7/ADR细胞的mdr-1、mrp在mRNA和蛋白质表达水平上均显著降低(P<0.05);细胞对ADR、表柔比星、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的耐药指数均显著降低(P<0.05).结论 耐药基因反义寡脱氧核苷酸能在体外抑制耐药基因的表达,从而提高细胞的药物敏感性;纳米微粒具有较好的体外介导反义寡脱氧核苷酸转染效果.