端粒酶抑制剂筛选模型诱饵载体的构建与转化

目的构建含不同人端粒酶RNA基因片段的诱饵融合表达载体并转化酵母,用于酵母三杂交方法筛选端粒酶抑制剂。方法采用RT—PCR方法从肿瘤细胞中扩增人端粒酶RNA（hTR）基因后,分别扩增hTR基因假结合体区CR4-CR5及H／ACA和CR7区hTR基因片段,纯化分离定向克隆到pRH3诱饵质粒,构建包含不同hTR目的基因片段的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定后,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。结果测序结果证实,含不同hTR基因片段诱饵重组质粒pRH3-hTR构建成功,转化酵母后无毒性和自激活性。结论成功构建了酵母三杂交系统诱饵载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及在酵母中研究hTERT和hTR间的相互作用．     

人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建

目的 对人端粒酶RNA进行多位点的突变并构建该突变体的酵母三杂交诱饵质粒,且进行毒性检测.方法 根据人端粒酶RNA(hTR)序列及突,变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法埘hTR基因的第41位、第80位及第102位碱基进行T→A突变,将突变后的片段克隆入PMD18T载体.经测序正确后再亚克隆到酵母三杂交诱饵质粒PRH3′中,PCR及酶切鉴定.鉴定成功的重组诱饵质粒转化到酵母细胞L40ura3/pHyblex/ZeoMS2进行毒性检测.结果 经过测序验证,该基因预期位点突变成功且其他序列未发生随机突变,重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主无毒性.结论 成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3′-hTRm,可作为酵母三杂交系统中的"诱饵".     

HLH缺失型Id2在酵母双杂交系统中的表达及自激活检测

目的:构建HLH结构域缺失的DNA结合抑制因子(Id2)诱饵质粒,并检测其在AH109酵母中的表达及表达产物对酵母的有无毒性作用和对报告基因的有无转激活作用。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒,将构建成功的诱饵质粒转化AH109感受态酵母菌中,检测其是否具有自激活作用及对酵母的毒性作用,用Western blot方法检测其在酵母中表达的融合蛋白。结果:成功构建Id2的HLH缺失体,Id2的HLH缺失体在酵母中能够正确表达,对AH109酵母无毒性作用,对报告基因无自激活作用。结论:HLH结构域缺失型Id2蛋白适用于采用酵母双杂交系统筛选其相互作用蛋白。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

AMP激活的蛋白激酶α2大肠杆菌双杂交诱饵重组质粒的构建及鉴定

目的 构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒.方法 PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinase α2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBTAMPKα2.经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 Blue MRF'大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达.并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 Blue MRF'菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用.结果 酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确.诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcL/AMPKα2融合蛋白.转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 Blue MRF'大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用.结论 构建的pBT-AMPKαt2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选.     

人HL-60细胞GRα-LBD诱饵表达载体的构建和鉴定

目的:构建糖皮质激素(Glueocorticoid,GC)受体α配体结合域(GRα-LBD)的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础.方法:RT-PCR扩增HL-60细胞的GR α-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR α-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果:成功扩增了GRα-LBD,并成功亚克隆到pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Westrrn blot分析也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论:成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础.     

在酿酒酵母中表达人血清白蛋白

目的：利用酵母表达系统表达人血清白蛋白（HSA）。方法：用PCR方法扩增HSAcDNA,利用限制性内切酶将含HSA片段定向插入酵母表达质粒pYET中构建分泌型重组表达载体pYET-HSA,通过DNA测序确定构建的融合蛋白基因序列的正确性。用重组质粒转化酿酒酵母感受态细胞,在亮氨酸营养缺陷型培养基上筛选含重组质粒的酵母转化子菌落。培养转化子酵母,表达HSA,经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶（SDS．PAGE）和Westernblot检测表达情况。结果：DNA序列分析显示,编码外分泌型HSA的基因构建成功。免疫印迹和SDS．PAGE检测结果显示,pYET-HSA酵母转化子可在非诱导条件下表达分泌型可溶性HSA。结论：在酿酒酵母中成功表达HSA。     

Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建Nar1基因的酵母表达载体,并纯化His-Nar1融合蛋白,为进一步研究Nar1的相互作用蛋白及其功能奠定基础。方法:通过PCR扩增Nar1全长基因;通过定向克隆的方法将Nar1片段与载体pYES2/NTC连接;通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株INVSc1;再通过免疫沉淀的方法纯化His-Nar1融合蛋白;通过Western blot检测靶蛋白。结果:DNA测序验证穿梭表达质粒pYES2/NTC-Nar1构建成功,Western blot检测到融合蛋白His-Nar1的表达。结论:成功构建Nar1酵母过表达载体,并且可以有效表达融合蛋白His-Nar1。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.     

酵母双杂交诱饵蛋白RGS4融合表达质粒的构建及鉴定

目的研究糖皮质激素受体各个结构域与G蛋白信号转导负调节因子4（RGS4）之间是否存在相互作用,构建酵母双杂交系统诱饵蛋白融合质粒。方法采用RT-PCR方法扩增RGS4片断全长,酶切回收,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,构建重组质粒pGBKT7-RGS4,并经酶切和测序等方法鉴定后,使用Y187酵母菌检测重组质粒的自激活现象及毒性。然后,提取酵母总蛋白,采用Western blot方法检测重组质粒在Y187内的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果RT-PCR扩增的RGS4基因片断电泳后,大小正确,重组质粒,pGBKT7-RGS4测序结果与GenBank中RGS4基因序列比对完全正确。重组质粒pGBKT7-RGS4双酶切鉴定、体外转录翻译实验,Western blot等方法均证实重组质粒中的RGS4基因能够正确合成RGS4蛋白。转化酵母后排除重组质粒的自激活作用。结论构建重组质粒pGBKT7-RGS4,能够在Y187内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。