2-BFI对EAE小鼠iNOS和COX-2 mRNA表达的影响

目的探讨咪唑啉2受体(I2R)高选择性高亲和力配体2-BFI对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)mRNA表达的影响。方法使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)抗原诱导EAE小鼠模型。采用临床症状评分、病理学检查和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察完全福氏佐剂(CFA)对照组、EAE组和2-BFI干预组小鼠行为学、中枢炎性细胞浸润及iNOS和COX-2mRNA表达变化。结果 2-BFI干预组较EAE组临床症状明显减轻(P<0.01),中枢炎性细胞浸润显著减少(P<0.01),iNOS和COX-2的mRNA表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论 I2R高选择性配体2-BFI对EAE小鼠具有一定保护作用,其作用机制可能与降低iNOS和COX-2 mRNA表达有关。     

2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的探讨咪唑啉Ⅱ类受体(I2R)高选择性配体2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法 C57BL/6小鼠30只,随机分成EAE组、2-BFI组和对照组,每组10只。EAE组及2-BFI组给予皮下注射抗原液诱导为EAE模型;2-BFI组同日起腹腔注射2-BFI共14 d。各组每日进行2次神经功能缺损评分;第19 d进行脊髓病理学检查,免疫组化法观察脊髓炎症细胞浸润、髓鞘脱失程度及GFAP表达。结果 2-BFI组神经功能缺损评分(4.17±3.65)明显低于EAE组(10.41±3.02)(P<0.01);脊髓病理评分(1.10±0.59)较EAE组(2.38±0.86)显著减少(P<0.01);GFAP阳性细胞数[(18.83±2.31)个/HP]明显多于EAE组[(12.25±2.66)个/HP](P<0.05)。结论 2-BFI能减缓小鼠EAE疾病发展,可能与促进中枢神经系统中GFAP的表达有关。     

2-BFI对EAE小鼠血脑屏障通透性和AQP4 mRNA表达的影响

目的观察2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠血脑屏障和水通道蛋白4(AQP4)mRNA表达的影响。方法 C57BL/6小鼠39只随机分为正常对照组、EAE组和2-BFI干预组。各组每日进行神经功能缺损评分;第20天进行病理学检查;伊文思蓝荧光定量方法检测血脑屏障通透性;电子显微镜观察血脑屏障的超微结构变化;Real-time PCR法测定AQP4 mRNA的表达水平。结果与EAE组比较,2-BFI干预组小鼠神经功能缺损及血脑屏障病理损伤减轻,AQP4 mRNA的表达水平明显降低,均差异有统计学意义。结论 2-BFI对EAE小鼠的神经保护作用与减少AQP4 mRNA的表达、减轻血脑屏障通透性有关。     

2-BFI、阿米洛利和咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学和病理学变化的药效作用比较

目的比较3种咪唑啉Ⅱ类受体(I2R)高选择性配体2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)、阿米洛利和咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠行为学和病理学变化的干预效果。方法在相同实验条件下,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽诱导EAE小鼠模型后,分为空白对照组、EAE-生理盐水组、EAE-2-BFI组(2-BFI干预)、EAE-阿米洛利组(阿米洛利干预)、EAE-咪唑克生组(咪唑克生干预),每组8只。均采用经实验证实的有效剂量,用动物神经功能评分评价各组间小鼠行为学表现。苏木精-伊红染色和LFB髓鞘染色,观察中枢组织炎性细胞浸润和髓鞘脱失程度。结果 3个不同配体干预组小鼠的神经行为学和炎症病理学改变与EAE-生理盐水组比较均明显减轻,差异有显著统计学意义(P0.01);而3个不同干预组之间的行为学和病理学变化比较无显著差异,2-BFI保护作用具微弱优势。结论 2-BFI、阿米洛利和咪唑克生均能明显减缓小鼠EAE发生与发展,均具有较好抑制中枢炎症反应的药理作用,3者间的药效作用强度未见明显差异。     

小胶质细胞在PLP_(139-151)诱导SJL小鼠EAE模型中的作用研究

目的观察髓鞘蛋白脂质蛋白139-151(proteolipid protein,PLP_(139-151))诱导SJL小鼠构建的复发缓解型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型复发期脑内小胶质细胞的病理改变。方法应用100μg、150μg PLP_(139-151)多肽片段免疫SJL小鼠构建复发缓解型EAE模型(分别简称为100μg PLP组、150μg PLP组),另设健康对照组(对照组;采用与实验组等体积溶媒处理),观察35 d。观察两组EAE小鼠的发病情况及神经功能残疾进展评分差异,选择发病快、神经功能残疾进展评分高者(计为EAE组)观察复发期小胶质细胞活化情况。EAE组于复发期疾病高峰时,对照组于相同时间点,取小鼠大脑皮层组织,应用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色及免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色比较两组小胶质细胞的活化情况。结果 150μg PLP组小鼠在两个发病高峰(分别为免疫第13、28天)均早于100μg PLP组(分别为免疫第15天、31天),神经功能评分第2次发病高峰高于100μg PLP组(3.00±0.79 vs. 1.75±0.90,t=2.33,P0.05),第1次发病高峰与100μg PLP组差异无统计学意义(P0.05),故选择150μg PLP组(计作EAE组)观察复发期(免疫后第28天)小胶质细胞活性。与对照组相比,EAE组小鼠复发期大脑皮层中小胶质细胞的活化明显增多,组织染色上表现为Iba-1表达增高,细胞体积增大,细胞突起增多。结论 150μg PLP_(139-151)多肽片段免疫SJL小鼠构建的复发缓解型EAE模型复发期小鼠大脑皮层小胶质细胞明显活化。     

趋化因子MCP-1、MIP-1α在EAE小鼠脊髓中的表达

目的:研究单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的关系。方法:用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白_(35-55)多肽加福氏完全佐剂皮下注射免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,用免疫组织化学方法观察EAE小鼠发病后第0天(初期)、第7天(高峰期)及第30天(恢复期)脊髓中MCP-1、MIP-1α的表达的变化,并通过免疫组化染色标记星形胶质细胞及小胶质细胞,判断MCP-1、MIP-1α的细胞来源。结果: MCP-1、MIP-1α在EAE小鼠发病初期脊髓中有少量表达,发病高峰期表达增高,而恢复期无表达,MCP-1主要由星形胶质细胞产生,MIP-1α主要由小胶质细胞产生;对照组小鼠脊髓中则没有MCP-1、MIP-1α表达。结论:趋化因子MCP-1、MIP-1α在EAE小鼠CNS不同胶质细胞中表达,是EAE发病早期募集免疫反应细胞向CNS浸润的重要致炎性因子。     

干扰素β-1b对实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓中趋化因子MCP-1表达的影响

目的研究干扰素（IFN）β-1b对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中枢神经系统（CNS）中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响，从趋化因子角度探讨IFNβ治疗多发性硬化（MS）的机制。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35～55多肽加福氏完全佐剂皮下注射免疫C57BL／6小鼠建立EAE模型，干预组（n=12）在免疫当天至免疫后第16天隔日一次皮下注射10000单位IFNβ-1b，对照组（n=12）则同时予1mL PBS皮下注射。比较两组EAE小鼠的临床表现，并用免疫组织化学及原位杂交技术比较两组EAE脊髓中MCP-1表达及MCP-1mRNA水平的差异。结果与对照组相比，IFNβ-1b干预组小鼠发病明显延迟，症状明显减轻，同时脊髓中MCP-1的表达及MCP-1mRNA的水平显著下调。结论IFNβ-1b可抑制EAE小鼠CNS中趋化因子MCP-1的表达，这可能是其治疗MS的机制之一。     

大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎中一氧化氮的变化

目的　观察外周和中枢一氧化氮 (NO)在大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎 (EAE)中的动态变化 ,探讨EAE大鼠发病的相关生物学机制。方法　 采用免疫组化法和硝酸还原酶法 ,观察豚鼠全脊髓匀浆诱导的Wistar大鼠EAE的过程中 ,脊髓内表达iNOS胶质细胞与外周NO代谢物NO 2 和NO 3的变化。 结果　 对照组脊髓内未发现表达iNOS阳性细胞 ,表达iNOS的CNS胶质细胞可能是小胶质细胞 ,而且它的变化与EAE大鼠的病情一致 ,评分 2分和 3分EAE大鼠脊髓表达iNOS的小胶质细胞比评分 1分大鼠明显增多 (P <0 .0 1) ,恢复期EAE大鼠表达iNOS的小胶质细胞明显减少 (P <0 .0 1)。EAE大鼠外周血清NO值随症状程度加重而升高 ,但在EAE恢复期时仍保持较高水平。未发病大鼠血清NO值明显增高 ,与对照组之间具有显著性差异 (P <0 .0 1)。 结论　 小胶质细胞产生的NO可能在急性期EAE大鼠的发病中起重要作用     

载脂蛋白E拟肽对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的影响

目的探讨载脂蛋白E(Apo E)拟肽对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响。方法将30只雌性C57BL/6J小鼠随机分为Apo E拟肽组、EAE组和正常组,每组10只小鼠。EAE模型通过以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55为抗原诱导。Apo E拟肽组在免疫后第2 d到30 d每隔2 d按5 mg/(kg·d)背部皮下注射Apo E拟肽。EAE组和正常组均以等体积生理盐水替代。免疫后第0~35 d每日对小鼠进行神经功能评分。免疫后第35d解剖小鼠,分离大脑和脊髓并行HE染色。采用免疫组化染色法检测各组小鼠大脑、脑干和脊髓的MMP-9和TIMP-1的表达。结果正常组小鼠均未发病。Apo E拟肽组、EAE组的小鼠全部发病,但各有1只小鼠发病后死亡。Apo E拟肽组与EAE组的发病潜伏期差异无统计学意义(P=0.72)。Apo E拟肽组的神经功能评分在峰值和慢性期(第35 d)均明显低于EAE组(均P0.05)。HE染色示,正常组未见炎症细胞浸润;EAE组小鼠大脑、脑干和脊髓均有不同程度的炎性细胞浸润,以脑干和脊髓较为明显;Apo E拟肽组小鼠CNS炎性细胞浸润相对于EAE组明显减少。EAE组小鼠大脑、脑干和脊髓的MMP-9表达均高于正常组(均P0.05)。Apo E拟肽组小鼠大脑和脊髓的MMP-9表达要明显低于EAE组(均P0.05),其中Apo E拟肽组小鼠中脑和脊髓的MMP-9表达与正常组相比无明显差异(均P0.05)。正常组小鼠脊髓TIMP-1的表达明显高于EAE组和Apo E拟肽组(均P0.05)。而Apo E拟肽组与EAE组小鼠大脑、脑干和脊髓TIMP-1表达的差异均无统计学意义(均P0.05)。结论 Apo E拟肽能通过抑制大脑和脊髓MMP-9的表达改善EAE小鼠的症状。     

芬戈莫德对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脑组织基质金属蛋白酶-9表达影响的研究

目的探讨芬戈莫德对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脑组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA及蛋白表达的影响。方法 48只雌性C57BL/6小鼠随机分为完全弗氏佐剂(CFA)组、EAE组、芬戈莫德组。运用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55构建EAE小鼠模型,小鼠神经功能缺损评分达到1分或免疫第14天,芬戈莫德组腹腔注射芬戈莫德10 mg·kg-1,相应的CFA组、EAE组给予生理盐水。观察小鼠行为学变化,中枢炎症和脱髓鞘情况,脑组织中的MMP-9 mRNA及蛋白表达。结果芬戈莫德组小鼠临床症状减轻,体重下降减少,潜伏期延长,发病率降低,炎性病灶数减少,脱髓鞘程度减轻。芬戈莫德组MMP-9 m RNA和蛋白表达水平较EAE组降低。结论芬戈莫德能抑制EAE小鼠脑组织中MMP-9 mRNA及蛋白表达水平。     

Tissue expression of inducible nitric oxide synthase requires IFN-gamma production by infiltrating splenic T cells: more evidence for immunosuppression by nitric oxide

The cause of increased severity of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in inducible nitric oxide synthase (iNOS)(-/-) or IFN-gamma(-/-) mice remains unclear. Transient chimeras were generated to examine the source of iNOS-inducing IFN-gamma in the central nervous system (CNS). IFNgamma(-/-) donor cells induced severe EAE but no iNOS expression in the CNS of wild-type recipients upon their immunization. By contrast, milder EAE, but strong iNOS expression was induced in immunized recipients of wild-type donor spleen cells. These results demonstrate that IFN-gamma secretion by infiltrating spleen cells is essential for iNOS expression during CNS inflammation. Furthermore, splenic NO is immunosuppressive.     

法舒地尔通过诱导EAE小鼠Occludin表达抑制其炎性细胞浸润

目的观察法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的治疗效果并探讨其作用机制。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫建立国际标准的小鼠EAE模型。将免疫后的42只雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE组、Fasudil早期治疗组和Fasudil晚期治疗组。Fasudil早期治疗组即免疫后第3天按体质量40mg/(kg.d)腹腔注射Fasudil,1次/d,至免疫后30d;Fasudil晚期治疗组即免疫后首只小鼠出现症状即开始腹腔注射Fasudil,注射方法和剂量同Fasudil早期治疗组;与晚期治疗组给药同一时间,给予EAE组等量生理盐水作为对照。免疫后隔天观察各组小鼠临床评分和体质量变化。于免疫30d后处死动物,分离小鼠脊髓腰膨大和脑冠状位中部1/3处做冷冻切片,行HE染色和免疫荧光染色。同时提取小鼠脊髓蛋白检测Occludin蛋白的表达。结果 Fasudil可改善EAE的临床症状,抑制脑血管内皮细胞Rho激酶(ROCK)活性。与EAE组相比,Fasudil早期治疗组和晚期治疗组CD31阳性内皮细胞上p-MYPT1表达均减弱(P<0.01,P<0.05),起病时间均延长(P<0.01,P<0.05),脊髓Occludin蛋白表达均增加(P<0.05)。结论 Fasudil对EAE具有治疗的潜能,其机制可能为通过抑制血管内皮细胞ROCK活性,参与诱导内皮细胞紧密连接蛋白Occludin的表达,从而抑制炎性细胞的中枢浸润,最终阻止疾病的发生和发展。     

咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠小胶质细胞激活和白介素17、肿瘤坏死因子α表达的影响

目的观察咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠脑组织中小胶质细胞、白介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法 SD大鼠30只随机分成3组:EAE-咪唑克生组(免疫当日开始给予咪唑克生2 mg·kg~(-1),腹腔注射,连续14 d)、EAE-生理盐水组(给予相同剂量生理盐水)和空白对照组。用豚鼠全脊髓匀浆免疫诱导制作EAE大鼠模型。每天观察评估各组大鼠神经功能变化;苏木精-伊红染色观察病理学改变;免疫组化法检测小胶质细胞(Iba1阳性)的激活与表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测发病高峰期(免疫后15 d)脑组织中IL-17,TNF-α表达水平。结果与EAE-生理盐水组比较,EAE-咪唑克生组(1)日均神经功能评分降低(P0.05),最大临床症状评分显著降低(P0.01);(2)苏木精-伊红染色:中枢炎症细胞浸润减少(P0.05);(3)免疫组化:Iba1阳性细胞表达减少(P0.05);而EAE-生理盐水组大鼠腰髓内Iba1阳性细胞表达较空白对照组明显升高(P0.01);(4)ELISA:炎性细胞因子IL-17和TNF-α表达明显降低(P0.01)。结论咪唑克生能够减缓大鼠EAE病情,其机制可能与抑制中枢神经系统小胶质细胞激活,下调中枢神经系统炎症因子IL-17和TNF-α的表达,扰乱中枢神经系统内炎症因子的平衡有关。     

口服法舒地尔治疗EAE对巨噬细胞、T细胞及TLR/NF-B通路的作用研究

目的探讨口服盐酸法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)小鼠巨噬细胞及TLR/NF-B通路的作用。方法采用小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55peptide,MOG35-55)诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,将EAE小鼠随机分为EAE模型组和Fasudil治疗组,免疫后第3天给予Fasudil治疗组小鼠Fasudil灌胃干预,直到免疫后第27天,EAE模型组同样处理给予等量生理盐水。光镜观察脊髓组织CD4+T细胞/CD68巨噬细胞表达的变化,Western blot法测定脊髓诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、Toll样受体2(TLR-2)、TLR-4和磷酸化核因子B(p-NF-B)蛋白的表达,ELISA法测定培养72h脾细胞分泌细胞因子的含量。结果与EAE模型组比较,Fasudil组CD4+T细胞数和CD68巨噬细胞数明显减少(P0.01),巨噬细胞M1表型iNOS表达减少(P0.05),M2表型Arg-1表达增加(P0.01),炎性通路蛋白p-NF-B、TLR-2和TLR-4表达减少(P0.05),外周细胞炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)和IL-17分泌减少(P0.05),而IL-10分泌增加(P0.05)。结论口服Fasudil可抑制CD4+T细胞/CD68巨噬细胞的激活,促进巨噬细胞表型M1向M2转化,抑制脊髓组织中p-NF-B、TLR-2和TLR-4的表达,抑制外周免疫细胞炎性因子分泌,而增加IL-10的分泌。     

Activation of histamine H2 receptors ameliorates experimental allergic encephalomyelitis

Experimental allergic encephalomyelitis (EAE), a model of multiple sclerosis, is an autoimmune, demyelinating disease of the CNS. Pro-inflammatory cytokines (e.g. tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interleukin (IL)-12) and reactive oxygen species are implicated in promoting EAE. Since histamine H(2) receptor activation suppresses production of O(2)*-, TNF-alpha, and IL-12 by inflammatory cells, we tested the hypothesis that dimaprit, an H(2) agonist, would reduce the clinical severity and pathology of EAE. Dimaprit treatment significantly reduced clinical signs compared to vehicle in both C57BL/6 and iNOS deficient EAE mice. Furthermore, dimaprit significantly reduced CNS staining for lectin-positive macrophages and decreased extravasated albumin staining, an indicator of blood-brain barrier leakage. These data provide a rationale for exploring H2 receptor activation for therapeutic value in multiple sclerosis.     

氯喹对EAE模型小鼠神经元损伤的影响

目的观察氯喹对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脊髓神经元存活的影响,并探讨相关机制。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,造模成功后给予氯喹干预。应用Knoz法进行临床评分,脊髓腰膨大节段石蜡包埋、冠状切片,行苏木精-伊红、LFB和Nissl染色,分别观察各组小鼠脊髓炎症反应、髓鞘脱失和神经元存活情况。脊髓腰膨大冷冻切片,行免疫荧光双标染色。同时提取脊髓腰膨大组织蛋白检测凋亡相关蛋白表达。结果氯喹缓解EAE小鼠临床症状,减轻脊髓炎性细胞浸润、髓鞘脱失、以及神经元死亡和损伤。与对照组相比,氯喹治疗组脊髓Bax水平降低,Bcl-2水平升高,Bax/Bcl-2比值降低。Neu N与Bcl-2荧光共定位明显增强。结论氯喹可能通过调节中枢神经系统前凋亡蛋白水平、上调神经元Bcl-2表达,从而减轻EAE小鼠神经元损伤以及神经功能缺失症状,发挥神经保护作用。