人脾贴壁细胞中TNFα转换酶cDNA的克隆以及LPS对其表达的影响

根据TNFα转换酶（TNFα converting enzyme，TACE）cDNA序列和TACE分子结构特征设计并合成引物，采用逆转录PCR(RT-PCR)技术，首次从健康人脾贴壁细胞中扩增出TACE cDNA解整合素结构片段（disintegrin do-main），并用大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激人脾贴壁细胞，观察其对TACE mRNA表达的调节作用。结果表明：不同健康人脾贴壁细胞中均存在TACEmRNA的自然表达，并且LPS对该表达具有上调作用，其上调程度与LPS刺激时间呈正比关系。     

人TNFRI cDNA的克隆及酵母表达载体的构建

本实验利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以人单核淋巴细胞系U937细胞总RNA为模板,扩增出人TNFRI型受体胞外区约224个氨基酸残基的cDNA序列,将此片段为模板,采用剿式PCR技术扩增出编码TNFRI胞外区约180个氨基酸的DNA序列,将其克隆于载体PDM18-T进行序列测定,随后构建于新型酵母表达载体PGBKT7-DNA-BD,为进一步通过酵母双杂交获得拮抗TNFRI的具有生物学活性的多肽奠定了基础.     

低氧对人血管内皮细胞血管紧张素转换酶2表达影响的研究

目的 观察低氧环境对人血管内皮细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)表达的影响,并初步探讨其作用机制.方法 人脐静脉内皮细胞株(HUVECs),进行贴壁细胞培养;采用免疫组织化学方法对细胞株进行Ⅷ因子鉴定,设立低氧实验组与常氧对照组.低氧组条件为1%O2+94%N2+5%CO2,常氧对照组的细胞置于5%CO2+95%空气孵箱内培养,37℃培养3 h、6 h、12 h、24 h,收集培养液和细胞;采用免疫组化鉴定ACE2蛋白合成情况,实时荧光定量RT-PCR检测ACE2 mRNA表达水平.结果 ①与常氧组对照,低氧3 h、6 h、12 h、24 h组ACE2蛋白表达均有所下降(P均≤0.00625),其中低氧3 h组的阳性率最低为14.53%,并且随时间延长呈现逐渐上升趋势;②与常氧对照组相比,低氧3 h、6 h、12 h、24 h组ACE2 mRNA表达量均有所下降,其中低氧3 h组ACE2mRNA相对表达率为0.281(P=0.031),低氧6 h组为0.445(P=0.034),低氧12 h组为0.794(P=0.434),低氧24 h组为0.891(P=0.692).结论 在24 h内,低氧使人血管内皮细胞ACE2蛋白的合成以及ACE2 mRNA的表达减少,并且以3 h最为明显,后出现逐渐升高趋势.这种先减少后增加的趋势,提示逐渐升高的ACE2对血管内皮缺氧损伤后的肾素血管紧张素系统(RAS)的反向调节有着重要作用.     

重组人蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与测序

蛋白激酶ＣＫ２曾称酪蛋白激酶２（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ２）是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的在真核细胞中普遍存在的ｃＡＭＰ非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶［１］。在进化过程中ＣＫ２的各亚基均表现出高度保守性,属于一种看家酶。该酶在许多...     

肿瘤坏死因子-α转换酶基因金属蛋白酶区的克隆及表达

目的: 克隆和构建含有肿瘤坏死因子-α转换酶金属蛋白酶区(metallopro teinase dom ain of human tumor necrosis factor-αconve rting enzyme,TACEmp)基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达。方法: 用RT-PCR方法,从THP-1细胞中扩增出TACEmp基因片段,插入表达载体pET-DsbAmut,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果: 克隆TACEmp基因并构建重组表达载体pET-DsbAmut-TACEmp转化入BL21,IPTG诱导后获得高效表达的TACEmp融合表达蛋白。结论: 利用分子伴侣融合蛋白技术使TACEmp在原核表达系统中获得了高效可溶性表达。     

正常小鼠睾丸的酶组织化学及氯化镍对其影响

用6O只LACA纯系成年雄性小鼠的睾丸,研究一组酶的代谢特点和分布规律及不同剂量氯化镍对其各种酶活性的影响。结果表明I型黄递酶主要见于间质细胞和晚期精子细胞;琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶见于晚期精子细胞;非特异性酯酶见于间质细胞;而5’-核(艹廿)酸酶主要见于围腔小室细胞。一次性腹腔注射不同剂量的氯化镍对睾丸酶活性未见显著影响。     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定

目的:利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA,并构建其原核表达载体.方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL,将其连接于克隆载体pMD18-T中,并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性.结果:应用RT-PCR技术和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切成功获得1049 bp的目的片段,测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同.结论:成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.     

人白介素—1β转换酶的克隆及重组质粒构建

白介素－1β转换酶（nitereukin－1β－conver－tingenzyme，ICE）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一员。研究提示，ICE可能在哺乳类细胞凋亡过程中起重要作用。为进一步了解该基因在凋亡诱导中的作用，以及潜在的临床应用价值，我们克隆了人ICE的CDNA序列，并构建了相应的真核?..     

人肿瘤坏死因子α基因cDNA直接注入小鼠骨骼肌表达的初步研究

本实验将带有人肿瘤坏死因子α基因（ＴＮＦ－α基因）ｃＤＮＡ的重组表达质粒直接注入小鼠骨骼肌内，观察了外源基因在小鼠体内的表达情况。双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法显示，实验组小鼠肌注１５ｄ后血浆中ＴＮＦ蛋白含量逐渐增高并达高峰，然后开始下降。ＲＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ结果显示，肌注２０ｄ时实验组中ＥＬＩＳＡ阳性的小鼠，其肌注处肌肉组织有ＴＮＦ－α基因表达。由此表明，直接将外源ＤＮＡ导入骨骼肌细胞内是基因转移     

转换酶抑制剂对高血压病患者糖代谢的影响

本文采用卡托普利和依那普利治疗高血压病患者２５例，剂量分别为２５－３７．５ｍｇ．ｄ＾－１，１０－２０ｍｇ．ｄ＾－１，疗程平均２８ｄ，观察转换酶抑制剂对高血压病患者血糖及血胰岛素的影响。结果表明，转换酶抑制剂在降压的同时可使餐后血糖和胰岛素水平有一致性的下降，提示转换酶抑制除降压作用外，尚能够改善高血压病患者的糖代谢紊乱。     

脂多糖LPS对糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞RBD-2表达的影响

目的以肺泡巨噬细胞为研究对象,观察脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激下RBD-2（大鼠β防御素-2,Rat-βdefensins-2）在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达的变化。方法以健康雄性SD大鼠制备糖尿病模型。32只大鼠随机分为四组：正常对照组（A组）、糖尿病组（B组）、LPS组（C组）和糖尿病＋LPS组（D组）,每组均为8只。分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR以及Western blotting分别检测RBD-2的RNA及蛋白质表达水平,同时通过Real Time PCR检测大鼠肺泡巨噬细胞的TLR-2以及TLR-4的mRNA的表达。结果大鼠糖尿病模型构建成功。RT-PCR以及Western blotting结果显示,与正常组相比,糖尿病组、正常组＋LPS组、糖尿病＋脂多糖组的RBD-2 mRNA以及蛋白质表达水平依次增加,差异显著（P〈0.05）。Real Time PCR结果显示,与正常组相比,糖尿病组、正常组＋LPS组、糖尿病＋脂多糖组的TLR-4 mRNA的表达水平依次增加,差异显著（P〈0.05）,而TLR-2差异则不明显。结论 LPS刺激后糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞RBD-2表达增加较糖尿病组更为显著,说明RBD-2变化对于增强糖尿病机体的非特异性免疫能力具有明显的帮助,同时糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞RBD-2表达较正常组增高,说明处于糖尿病时期的大鼠机体处于炎症状态,并且这一通路的表达受体主要是TLR-4受体。     

血管紧张素转换酶抑制剂治疗心力衰竭时淋巴毒素α水平的表达

目的:探讨转换酶抑制剂(ACEI)对慢性心力衰竭中淋巴毒素α水平的影响.方法:应用双抗体夹心酶联免疫(ELISA)方法检测78例CHE患者服用ACEI后血液中LTA浓度的变化.结果:CHE患者服用ACEI后血浆LTA水平(12.63±3.61 pmoL/L),显著低于服药前水平(23.67±9.22pmoL/L).结论:证明ACEI对降低CHE患者血浆中LTA水平有显著作用.     

葡萄糖对血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖损伤血管内皮细胞及其对内皮素转换酶-1b表达的影响。方法 将人脐静脉内皮细胞株ECV304分别培养在含0mmol／L(对照组)、5．5mmol／L(处理组1)、11．1mmol／L(处理组2)、22mmol／L(处理组3)、33mmol／L(处理组4)葡萄糖的培养基中。经葡萄糖培养24h后，噻唑蓝法测定细胞增殖活性，硝酸还原酶法测定培养上清液中一氧化氮浓度及比色法检测培养上清液中丙二醛的浓度，逆转录聚合酶链反应法检测细胞中内皮素转换酶-1b mRNA。结果 发现随着葡萄糖浓度的增加，内皮细胞增殖呈浓度依赖性抑制；一氧化氮浓度呈浓度依赖性增加：丙二醛浓度呈浓度依赖性增加；内皮素转换酶-1b mRNA的表达呈浓度依赖性增加。结论 高浓度葡萄糖可损伤内皮细胞并诱导血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b mRNA表达，此变化可能与糖尿病患者高血糖致血管病变有关。     

山莨菪碱对LPS诱导的急性肺损伤大鼠肺组织TNFα、IL-8表达的影响

目的探讨山莨菪碱(654-2)对内毒素致伤急性肺损伤(ALI)大鼠的防治作用和可能机制.方法观察654-2对ALI大鼠血气分析和肺组织损伤的影响,并采用原位杂交法检测肺组织TNFα、IL-8 mRNA表达和ELISA检测肺组织匀浆TNFα、IL-8含量的改变.结果 654-2干预后可减轻ALI大鼠肺组织损伤程度,减少肺组织TNFα、IL-8 mRNA表达及其肺组织匀浆含量.结论 654-2可能通过抑制TNFα、IL-8 mRNA表达,减少肺组织中TNFα、IL-8产生而对ALI发挥防治作用.     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

LPS对小鼠巨噬细胞HIF-1α表达的影响

目的观察在体外常氧条件下，LPS的刺激是否影响巨噬细胞HIF-1α的表达及其机制。方法收集Balb／c小鼠的腹腔巨噬细胞并分组进行体外培养，刺激组给予LPS、对照组给予PBS并作用10h后。采用RT-PCR法检测HIF-1α、VEGF基因的表达水平，应用细胞免疫化学染色法检测HIF-1α蛋白的表达水平。结果LPS刺激组HIF-1α基因表达无明显改变，但HIF-1α蛋白表达显著增加且VEGF基因表达上调（均P〈0．01）。结论常氧条件下，LPS刺激下的巨噬细胞可以在转录后水平上调HIF-1α蛋白的表达，并可通过上调靶基因VEGF的表达参与急性炎症反应。     

卡维地洛对大鼠心肌TNF—α、TNF—αR1表达的影响

目的研究卡维地洛对大鼠心肌凋亡相关基因TNF-α、TNF-αR1表达的影响。方法SD大鼠随机分三组:对照组,阿霉素组,阿霉素 卡维地洛组;阿霉素腹腔注射(ADR 20 mg/kg)制备心肌毒性动物模型;卡维地洛组在注射阿霉素之后立即腹腔注射卡维地洛(Carv2 mg/kg);等量生理盐水用于对照组。于用药后第1、3、5、10、15天采用逆转录聚合酶链反应检测TNF-α,TNF-αR1在心肌细胞中的表达,HE染色检测心肌组织病理改变情况。结果GAPDH为内标,第1、3、5、10天阿霉素组TNF-α表达逐渐增强,TNF-αR1表达逐渐增强;阿霉素 卡维地洛组中TNF-α及TNF-αR1表达均逐渐增强;阿霉素 卡维地洛组与阿霉素组比较:TNF-α及TNF-αR1表达两组比较差异无显著性。HE染色结果:阿霉素组与卡维地洛组比较差异无显著性。结论(1)阿霉素的心肌毒性作用可增强心肌细胞凋亡相关基因TNF-α及TNF-αR1的表达;(2)卡维地洛对凋亡相关基因TNF-α及TNF-αR1的表达无影响;揭示卡维地洛对阿霉素心肌毒性的保护作用不能通过调节TNF-α、TNF-αR1的表达而实现。