反义微小RNA-21寡核苷酸抑制Tb3.1人舌鳞状细胞癌增殖的体外研究

目的 探讨反义微小RNA-21寡核苷酸(antisense oligonucleotide micro RNA-21,AS-miRNA-21)抑制Tb3.1人舌鳞状细胞癌增殖的效果和机制.方法 实验分3组,①空白对照组;②无义寡核苷酸转染组;③AS-miRNA-21转染组.寡核苷酸介导转染反义寡核苷酸敲低Tb3.1细胞miRNA-21表达.使用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)鉴定转染后Tb 3.1细胞miRNA-21表达水平;甲基噻唑基四唑(MTT)法检测转染后Tb 3.1细胞生存率;流式细胞术检测转染后Tb3.1早期凋亡;Matrigel基质生长实验检测转染后Tb 3.1细胞生长形成球形集落能力;Transwell体外迁移实验检测转染后Tb 3.1细胞迁移能力;蛋白质印迹法检测转染后Tb3.1细胞增殖核抗原(antigen KI-.67,Ki67)、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、基质金属蛋白酶2、9(matrix metalloproteinase 2/9,MMP-2、MMP-9)和组织基质蛋白酶抑制因子蛋白1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)蛋白表达.结果 荧光实时定量PCR显示转染后miRNA-21表达水平下调;转染第4天,AS-miRNA-21转染组肿瘤细胞生长速度[(53.43±11.83)%]低于其他两组[(91.32±8.02)%和100%](F=27.02,P=0.00);细胞凋亡率显著升高[(12.23±2.92)%,F=26.641,P=0.001];AS-miRNA-21转染组细胞生长不能形成球形克隆且通过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数小于空白对照组(F=268.231,P=0.000);Ki67、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达下调,PTEN和TIMP-1蛋白表达上调.结论 敲低miRNA-21后Tb3.1人舌癌细胞增殖与侵袭能力被抑制,并为探索miRNA-21调控人舌癌发生机制提供实验依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of micro RNA-21 (miRNA-21) knocking on the Tb3.1 human tongue squamous cell carcinoma growth. Methods Anti-sense miRNA-21 oligonucleotide was delivered with oligofectamine to suppress Tb 3. 1 tongue cancer cell growth in vitro. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was conducted to detect the miRNA-21 expression after transfection. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to determine Tb 3. 1 cell survival rate. Apoptosis were examined by flowcytometry. Matrigel matrix and transwell assay were used to determine Tb 3.1 cell colony formation and migration ability. Antigen KI-67 (Ki67), B cell lymphoma (Bcl-2), phosphatase and tensin homolog (PTEN), matrirx metalloproteinase 2(MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) protein expression in Tb 3. 1 cell were measured by Western blotting. Results miRNA-21 expression was decreased in miRNA-21 antisense oligonucleotide (ASODN) group. The survival rate of Tb 3. 1 cells with AS-miRNA-21 transfection was significantly suppressed (F=27.02, P = 0.00) and early phase apoptosis(F =26. 641 ,P = 0. 001) induced in Tb 3.1 cell. Ki67, Bcl-2, MMP-2 and MMP-9 protein weredown regulated while PTEN and TIMP-1 protein expression was increased. Conclusions Blocking miRNA-21 expression in Tb3.1 cell could suppress cancer cell growth in vitro and miRNA-21 can serve as a novel target candidate for human tongue cancer gene therapy.     

细胞周期蛋白D1反义寡核苷酸调控联合顺铂抑制口腔鳞癌耐药细胞的研究

目的通过体内外实验探讨细胞周期蛋白（cyclin D1）与舌鳞状细胞癌对顺铂（CDDP）耐药细胞系（Tca8113/CDDP）耐药的相关性.方法通过脂质体将cyclin D1正义、反义寡核苷酸序列分别导入Tca8113/CDDP细胞内.用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测转染细胞系和耐药细胞系体外生长增殖情况及对顺铂的敏感性.将被转染的细胞及Tca8113/CDDP细胞接种于裸鼠皮下,建立移植瘤模型,共18只,每组6只.给予顺铂腹腔注射治疗,观察移植瘤体积变化,绘制生长曲线;称取瘤重,计算抑瘤率;光镜下观察移植瘤组织病理学变化.结果转导mRNA 3＇cyclin D1反义寡核苷酸的Tca8113/CDDP细胞在动物体内外生长明显受到顺铂的抑制;裸鼠皮下移植瘤抑瘤率达74%（P＜0.05）,移植瘤重量较对照组和转导正义寡核苷酸序列组差异均有统计学意义（P＜0.05）;光镜下可见反义寡核苷酸组移植瘤坏死明显.结论cyclin D1基因的反义调控联合顺铂能抑制Tca8113/CDDP细胞的生长能力及体内移植瘤的生长.研究结果提示：抑制cyclin D1可能增加口腔鳞状细胞癌对顺铂的敏感度.     

舌鳞状细胞癌及癌周原位癌中心和边沿细胞增殖活性研究

目的　通过检测浸润癌及癌周原位癌中心区和边沿细胞增殖活性 ,分析舌鳞状细胞癌上皮内蔓延机制。方法　收治 16 9例舌鳞癌病例 ,伴有原位癌者共 16例。采用HE染色和免疫组化检测PCNA、Ki67蛋白及银染一步法检测NORs在舌鳞状细胞癌及癌周原位癌中心区和边沿中的表达。结果　正常上皮和原位癌之间 (P≤ 0 .0 1) ,原位癌和浸润癌之间 (P≤ 0 .0 1) ,浸润癌中心区和边沿之间 (P≤ 0 .0 1)细胞增殖活性有显著差异 ,而原位癌边沿和中心区之间无显著性差异 (P≥ 0 .0 5 )。结论　浸润癌边沿细胞具有较强的增殖活性 ,而原位癌中心区和边沿细胞增殖无明显差别。     

维吾尔族口腔鳞状细胞癌患者中血清鳞状细胞癌抗原的表达研究

目的 探讨维吾尔族口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者血清中鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)的表达.方法 采用化学发光法检测90例维吾尔族OSCC患者(OSCC组)和90例维吾尔族其他口腔恶性肿瘤患者(口腔非OSCC恶性肿瘤组)、101例维吾尔族口腔良性肿瘤患者(良性肿瘤组)和120例维吾尔族正常对照者(正常组)的血清SCC-Ag水平,并对其中60例OSCC和60例口腔非OSCC恶性肿瘤患者治疗前后SCC-Ag水平进行检测,分析SCC-Ag在OSCC诊断、治疗疗效中的意义.结果 OSCC组的SCC-Ag水平明显高于口腔非OSCC恶性肿瘤组(P=0.002),良性肿瘤组(P=0.001)和正常组(P=0.001).OSCC患者血清SCC-Ag阳性率为43.3％(39/90),明显高于其他3组(P=0.000 1).OSCC患者TNM晚期的术前SCC-Ag水平的表达高于早期水平(P<0.05).复发组和未复发组的术前、术后、放化疗后SCC-Ag水平相比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).手术及放化疗前后鳞状细胞癌患者血清SCC-Ag水平变化差异有统计学意义(P＜0.0 1),然而,在口腔非OSCC恶性肿瘤组治疗疗效差异无统计学意义(P>0.05).结论 血清SCC-Ag对维吾尔族OSCC患者的早期诊断敏感性不高,但在评价治疗疗效,预测肿瘤复发方面有重要的临床意义.     

口腔鳞状细胞癌Rb基因的检测

目的研究Ｒｂ基因异常与口腔鳞状细胞癌发生及临床病理指标的关系。方法应用地高辛高效引物标记Ｒｂ３．６ＫｂＤＮＡ探针，结合抗地高辛抗体碱性磷酸酶显色法，对口腔鳞癌病人中Ｒｂ基因改变进行了研究。结果在７／２８例口腔鳞癌中发现Ｒｂ基因结构异常，其中６例出现５．４、４．１及２．３Ｋｂ片段缺失，１例出现６．２Ｋｂ新片段；Ｒｂ缺失与临床病理指标无显著相关性。结论口腔鳞癌中存在Ｒｂ基因缺失、重排，可能与口腔鳞癌的发生有一定关系     

丙戊酸钠抑制口腔鳞状细胞癌生长的实验研究

目的:本实验探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对口腔鳞状细胞癌(Tca-8113)生长抑制情况以及促进凋亡的作用。方法:采用0、0.1、2.5、5、10、12.5、25、50、100mmol/L丙戊酸钠对口腔鳞状细胞癌进行干预,倒置相差显微镜观察细胞形态改变;CCK-8法检测细胞增殖活性;ELISA方法及Annexin-V-FITC/PI双染法检测对细胞凋亡的作用。结果:倒置相差显微镜下观察到对照组细胞呈多边形,贴壁,生长活跃;实验组细胞形态改变明显,大部分细胞核固缩,细胞变小、变圆、脱壁。细胞生长曲线显示,随丙戊酸钠浓度增加、时间延长,Tca-8113细胞生长明显受到抑制,各实验组细胞存活率与对照组相比(P<0.05),差别有统计学意义。2.5、10mmol/L丙戊酸钠作用24h,细胞总凋亡率分别为9.2%和26.7%,与对照组3.6%相比,差别均有统计学意义。结论:丙戊酸钠体外抑制口腔鳞状细胞癌生长,呈时间-剂量依赖性,并诱导细胞凋亡。     

口腔鳞状细胞癌与Rb、C-myc基因关系的研究

应用核酸分子杂交技术对28例口腔鳞癌组织中Rb、C—myc基因进行了研究，结果表明:鳞癌组织中6例出现Rb基因缺失、1例重排，分别占样本的21.4％和3．6％；12例出现C—myC基因扩增，1例重排，占样本的42．9％和3．6％，并且C—myc基因扩增与TNM分期有关。提示在口腔鳞癌中存在Rb抑癌基因失活和C—myc癌基因的激活，对鳞癌的发生、发展可能起着一定的作用。C—myc扩增可作为判断鳞癌预后的指标之一。     

microRNA表达调控与口腔鳞状细胞癌

［摘要］ 微小RNA(microRNA,miRNA)属于一类小非编码RNA,可以通过作用于目标信使RNA(messenger RNA, mRNA)来调控生物进程。miRNA具有作为肿瘤生物标志物和药物作用靶点的潜能,因此阐明其在肿瘤发生发展中的作用机制十分重要。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是一种常见的口腔恶性肿瘤,预后不良。该文对miRNA在OSCC中的生物学功能,相关表达谱改变,调控机制和临床应用前景作一综述。     

口腔鳞状细胞癌p53基因的免疫组织化学研究

随着肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，癌基因和抗癌基因在肿瘤发生和发展中的作用日益受到重视。Ｐ５３抗癌基因的产物是分子量为５３ＫＤ的核磷酸化蛋白质。已证明发生于１３２～２１５位氨基酸残基之间的突变可导致Ｐ５３蛋白失活，并表现出显性的癌基因转化作用［...     

百安对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系作用的初步研究

目的:研究中药提取物百安(活血化瘀抗肿瘤药)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的抑制作用。方法：采用细胞形态观察法、MTT法及活细胞计数法观察百安对Tca8113细胞的作用,同时以常用化疗药物顺铂为对照。结果：1：50稀释的百安对Tca8113细胞的抑制率1d为50％,且随时间增加而增加,百安联合顺铂对Tca8113细胞的协同作用不明显。结论：中药提取物百安对人舌鳞状细胞癌Tca8113有直接杀伤作用,且有时间依赖性,在人舌鳞状细胞癌的治疗方面有一定意义。     

放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的：探讨放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞耐药性的影响。方法：应用免疫组化SP法检测放疗对P-糖蛋白（P-glycoprotein,P—gP）、多药耐药相关蛋白1（muhidrug resistance associate protein 1,MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π（glutathione S—tranferase π,GST-π）表达的影响和检测放疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果：Tca 8113／CBDEA细胞在放疗后4hP—gP,MRP1,GST-π耐药蛋白表达无明显上升,24h耐药蛋白的表达明显升高（P〈0．01）,Tca8113细胞的耐药蛋白表达在4h和24h时均有明显上升（P〈0．01）。放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显下降。结论：放疗可引起舌鳞癌细胞的耐药。提醒我们对舌癌患者进行放疗和化疗的方案设计时应考虑此点。     

hTERT启动TRAIL基因的腺病毒载体对人舌鳞癌细胞影响

目的：探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒（Ad）为载体,人端粒酶（TERT）启动子引导的重组基因治疗药物AdTERT-TRAIL诱导人鳞状细胞癌细胞（TCa8113）凋亡的作用。方法：含有绿色荧光蛋白基因（EGFP）的腺病毒载体（AdTERT-EGFP）转染TCa8113细胞,确定重组腺病毒载体转染效率;AdTERT-EGFP为对照组,AdTERT-TRAIL为实验组感染TCa8113细胞,采用RT-PCR方法检测TRAIL的表达。应用倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：AdTERT-EGFP在1000p/cell时转染效率为100%。RT-PCR可检测到594bp的TRAIL基因。细胞转染AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP后,随时间细胞存活率逐渐下降,但AdTERT-TRAIL组较AdTERT-EGFP组下降更快,统计学分析有显著意义（P〈0.001）。AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP均能诱导TCa8113细胞凋亡,而AdTERT-TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdTERT-EGFP组大,统计学有显著差异（P〈0.0001）。结论：AdTERT-TRAIL在体外能明显抑制TCa8113细胞的活性,并能促进其凋亡。     

MAb225对Tca8113舌鳞癌细胞放射敏感性的影响

目的　探索表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体MAb225对舌鳞癌细胞Tca8113的放射敏感性的调控作 用。方法　不同浓度的MAb225处理Tca8113舌鳞癌细胞,通过集落形成实验单靶多击模型拟合放射生存曲线,分 析细胞的增敏比(SERD0)和存活分数(SF2)的变化。同时,建立裸鼠移植瘤模型,单独及联合应用MAb225和放射处 理裸鼠移植瘤,通过生长延缓实验观察肿瘤生长变化,并进行统计学分析。结果　MAb225有明显的放射增敏作 用,0·5 mg/LMAb225作用后的SERD0为1·23,在一定的范围内,其增敏作用与剂量存在正相关;MAb225明显提高放 射对裸鼠移植瘤的杀伤作用(P<0·05)。结论　MAb225可以提高舌鳞癌细胞Tca8113的放射敏感性。     

A型钾离子通道对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的影响

目的:探究A型钾离子(Potassium,K⁺)通道抑制后对舌鳞状细胞癌株(Tca8113)细胞的影响。方法:全细胞膜片钳技术记录和分析A型K⁺通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)对Tca8113细胞K⁺电流的影响;MTT检测A型K⁺通道对细胞增殖的作用。结果:在终浓度为2 mmol/L 4-AP作用下,A型K⁺电流的峰值从(267.04±13.84) pA降到(124.81 ±5.24) pA。在一定范围内,不同浓度4-AP能抑制Tca8113细胞在体外的增殖,且抑制程度随药物浓度和作用时间的增加而增强。结论:A型K⁺通道参与Tca8113细胞增殖的过程,且A型K⁺通道阻滞剂能抑制Tca8113细胞的增殖。     

粘着斑激酶对Tca8113舌鳞癌细胞生物学特性的影响

目的研究粘着斑激酶（FAK）在Tca8113舌鳞癌细胞中的表达及对其生长、粘附、侵袭转移能力的影响。方法采用FAK寡核苷酸转染的方法处理Tca8113舌鳞癌细胞,采用逆转录- 聚合酶链反应（RT- PCR）测定FAKmRNA水平的变化,间接免疫荧光方法检测胞浆FAK蛋白的表达,以Transwell小室和冲刷实验的方法计数细胞,测定细胞的粘附和侵袭能力的变化,MTT法检测细胞的生长抑制情况。结果反义FAK寡核苷酸转染后,Tca8113细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低。转染48 h后,FAKmRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。结论FAK对Tca8113细胞的增殖、存活、粘附及侵袭具有重要作用。     

转染BMPⅡ型突变受体前后Tca8113舌癌细胞中p27和p57表达的定量分析

目的：明确转染BMP—Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用,以进一步探讨、认识BMPs对口腔上皮恶变的作用机理。方法：检测转染BMP—Ⅱ型突变受体的Tca8113舌癌细胞(Tca8113ZR细胞)和Tca8113细胞的细胞周期相关因子p27和p57的表达,以明确突变受体对细胞周期及生长的影响。结果：转染了BMPⅡ型突变受体后,肿瘤细胞的增殖能力显著减弱。结论：BMPs信号在口腔舌癌细胞的恶性变化中起着重要的调控作用,BMPs信号的改变可能导致细胞的恶性程度的改变。     

Fas转染及抗体处理对舌鳞癌细胞Tca8113移植瘤形成和增殖的影响

目的　研究Fas转染和抗Fas单克隆抗体对舌鳞癌细胞系Tca8113裸鼠体内移植瘤形成和增殖的影响,探讨相关机制。方法　脂质体法以真核表达重组质粒pBK-fas转染舌鳞癌细胞系Tca8113。部分转染细胞行抗Fas单克隆抗体处理。未转染细胞、Fas转染细胞、Fas转染抗体处理细胞分别接种裸鼠皮下。观测移植瘤生长,绘制生长曲线。RT-PCR检测肿瘤细胞Fas mRNA表达。流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡、增殖及Fas蛋白表达。结果　Fas转染和抗体处理延迟肿瘤形成,抑制肿瘤增殖。Fas转染上调移植瘤Fas mRNA表达,提高Fas蛋白表达强度和凋亡指数,但不影响Fas蛋白阳性表达率和增殖指数。抗体处理不影响Fas mRNA和蛋白表达,但可提高凋亡指数,降低增殖指数。结论　Fas转染抑瘤效应是上调Fas转录和表达、促进凋亡的结果。抗Fas单克隆抗体抑瘤效应则与激活凋亡和抑制增殖有关。     

热疗对舌鳞癌Tca8113细胞及其耐药细胞株耐药性的影响

目的 探讨热疗对舌鳞癌Tca8113细胞和耐药的Tca8113/CBDEA细胞耐药性的影响。方法 采用实时定量逆转录PCR（RT-PCR）检测42 ℃,0.5 h热疗对Tca8113细胞 和耐药的Tca8113/CBDEA细胞多药耐药基因1（MDR1）、多药耐药相关蛋白1基因（MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π基因（GST-π）表达的影响以及检测热疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果 Tca8113/CBDEA细胞在热疗后4 h和24 hMDR1、MRP1、GST-π耐药基因表达量明显下降（P<0.01）,Tca8113细胞的MDR1、MRP1耐药基因表达在4 h和24 h时亦有明显下降（P<0.05）,GST-π在24 h有明显下降（P<0.01）。热疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显上升（P<0.01）。结论 热疗抑制了耐药基因的表达,增加了细胞内的药物浓度, 热疗可能是逆转肿瘤细胞耐药,提高化疗效果的一种有效手段。     

乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物表达的影响

目的　研究乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达的影响,探讨乏氧与口腔鳞 癌侵袭、转移的关系。方法　采用免疫组化染色和流式细胞术,对Tca8113细胞在不同乏氧时间(0、3、6、12、24 h)下 的uPA蛋白表达进行染色和定量分析。结果　乏氧可促进人舌癌Tca8113细胞uPA蛋白表达,而且随着乏氧时间 3 h→6 h→12 h→24 h的延长,uPA表达逐渐增高。结论　乏氧可通过激活肿瘤细胞高表达uPA而促进口腔鳞癌侵 袭和转移。