胱天蛋白酶3在啮齿类动物和猕猴脑中的表达：种系和年龄相关研究

背景：有研究显示，凋亡相关蛋白酶-胱天蛋白酶3被认为是动物和人脑中细胞凋亡过程中的关键酶，正常人或阿尔茨海默病患者的脑中有该酶的表达，这与对成年啮齿动物脑研究的结果之间存在着矛盾。目的：揭示胱天蛋白酶3在啮齿类动物和猕猴脑中的表达有无差异，分析该酶在猕猴脑中的表达水平有无年龄差异，以及不同猕猴脑区间有无差别。设计：单变量均数的平行比较。单位：解放军总医院肝胆外科研究所，香港中文大学解剖学系。材料：实验于2003-08／2005-02在解放军总医院肝胆外科研究所及香港中文大学解剖学系进行的，所用的2，12，24和48周龄（每周龄组n=5）SD大鼠、ICR小鼠和快速衰老小鼠（senescence—accelerated mice，SAM），雌雄不限，由香港中文大学实验动物服务中心提供；健康雌性4岁和20岁猕猴各4只，均购自解放军总医院医学实验动物中心（SCXK-（京）2003-002）。以上动物均在无任何实验干预的标准条件下养殖。方法：①所有脑组织标本均从猕猴和啮齿动物中新鲜切取，制成匀浆后通过免疫印迹法检测啮齿类动物和猕猴脑组织中胱天蛋白酶3蛋白的表达；②用同样的方法比较两个年龄组猕猴的大脑皮质、海马和小脑中该蛋白的表达量，并通过免疫组织化学法显示胱天蛋白酶3在猕猴3个脑区中的细胞分布状态。主要观察指标：①胱天蛋白酶3在啮齿类动物和猕猴脑中的免疫印迹检测；②胱天蛋白酶3在猕猴3个脑区中的细胞分布状态。结果：①免疫印迹检测结果：胱天蛋白酶3在3种2周龄的鼠脑中表达模式相同，在其它年长鼠脑中未检测到该酶；胱天蛋白酶3在成年和老年猕猴脑中均有持续表达，表达量低于2周龄鼠。胱天蛋白酶3在猴脑中以酶原（M，32000）的形式存在，未发现该酶在猕猴脑中的表达量有年龄和脑区差异。②免疫组织化学法显示结果：猕猴大脑皮质胱天蛋白酶3的免疫反应性很低，海马的CAI、CA3和CA4区可见低至中度阳性染色的锥体细胞，小脑皮质的少数浦肯野氏细胞呈强阳性染色。老年猕猴除运动皮质第V层偶见呈强阳性染色的大锥体细胞外，其余与成年猴无明显差别。结论：啮齿类动物成年后，脑中胱天蛋白酶3的表达迅速下降至测不出，而该酶在成年及老年猕猴脑中仍维持在一定水平，其表达量和阳性细胞的分布状态无明显的年龄差异。     

一氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的:观察急性一氧化碳中毒后脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化及氯化血红素对上述两者表达变化的影响。方法:实验于2005-01/08在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。150只雄性SD大鼠随机分成3组,每组50只。①一氧化碳中毒组:大鼠放入染毒罐,静式吸入一氧化碳与空气的混合气60min。造模后分别于1,3,5,7和14d处死,每个时间点10只大鼠。②氯化血红素治疗组:除给予一氧化碳中毒组同样的处理外,于造模后立即注射氯化血红素(30mol/kg,3次/d)直至相应时间点处死,每个时间点10只大鼠。③对照组:不作任何处理,在相应时间点处死。各组大鼠分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法,观察大鼠脑内的脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化。结果:150只大鼠均进入结果分析。①免疫组化阳性神经细胞数目:一氧化碳中毒组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目持续下降,至中毒后14d最低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞逐渐增多,至中毒后5d达高峰,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。经氯化血红素治疗后,与中毒组相比脑红蛋白的表达明显增多,与中毒组相比差异有统计学意义(P<0.01);同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的阳性细胞数明显下降,与中毒组相比差异有统计学意义(P<0.05)。②免疫蛋白印迹灰度分析:一氧化碳中毒组脑红蛋白的表达持续下降,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达上升,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);氯化血红素治疗组与中毒组相比,脑红蛋白表达量上升(P<0.01);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达下降,治疗5d最显著(P<0.01)。结论:一氧化碳中毒后大鼠脑红蛋白表达呈持续下降;刺激脑红蛋白表达可抑制急性一氧化碳中毒后大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。     

骨髓干细胞移植后Western blot免疫印迹分析鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化

目的:Western blot免疫印迹分析骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成。①选取7～8周龄mdx鼠25只,随机数字表法分为骨髓移植4,8,12,16周组、空白对照组,5只/组。另选取4～6周龄C57鼠20只作为供体鼠,10周龄C57鼠5只作为阳性对照组。②各组在移植前均给予照射剂量为7Gy的放疗预处理。放疗完毕后,骨髓移植4,8,12,16周组均进行尾静脉细胞移植,移植细胞数为2×107/只,0.3～0.5mL;空白对照组、阳性对照组尾静脉输入0.3mL磷酸盐缓冲液。③骨髓移植4,8,12,16周组分别于对应时间点处死,取其腓肠肌,制备抗肌萎缩蛋白样品,进行抗肌萎缩蛋白Western blot免疫印迹分析,以GAPDH作为内参。结果:25只7～8周龄mdx鼠、5只10周龄C57鼠全部进入结果分析。骨髓干细胞移植后抗肌萎缩蛋白Western Blot免疫印迹分析结果:空白对照组无抗肌萎缩蛋白的表达;骨髓移植4周组仅可见抗肌萎缩蛋白的微弱表达,dystrophin/GAPDH灰度比值约为0.095±0.267;骨髓移植12周组约为0.218±0.338;随骨髓移植时间的延长抗肌萎缩蛋白表达量逐渐增加,移植后16周的表达量较移植后8周明显增加(0.393±0.385,0.173±0.284;t=6.062,P<0.05),但仍明显低于阳性对照组1.172±0.328(t=3.14,P<0.05)。结论:骨髓干细胞移植mdx鼠后应用WesternBlot免疫印迹分析可于不同时间检测到抗肌萎缩蛋白的表达,且随移植时间延长表达量增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

光损伤诱导视网膜上皮细胞半胱天冬酶-3表达与促红细胞生成素的干预效应

背景:有实验表明,促红细胞生成素对视网膜的光化学损伤有保护作用,该作用与光化学损伤视网膜色素上皮细胞中半胱天冬酶-3表达的变化有关? 目的:采用光刺激诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡,观察不同剂量促红细胞生成素对细胞半胱天冬酶-3表达的影响.设计:观察对比实验.单位:青岛大学医学院.材料:成人视网膜色素上皮-19细胞株购自美国细胞培养收集公司.DMEM/F12混合培养基、新生牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO生物技术公司.重组人促红细胞生成素购自Sigma生物技术公司.人半胱天冬酶-3定量EIA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司.半胱天冬酶-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司;PV6001免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司.方法:实验于2006-05/2007-01在青岛大学医学院病理生理教研室完成.取成人视网膜色素上皮-19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型,传代细胞随机分为7组,每组4孔,①正常对照组:不加光照,不加促红细胞生成素药物干预.②光损伤模型组:光照12 h,不加促红细胞生成素药物干预.③光损伤 10 000U/L 促红细胞生成素组、光损伤 20 000 U/L 促红细胞生成素组及光损伤 40000 U/L 促红细胞生成素组:光照12 h,分别加10 000、20 000及40 000 U/L促红细胞生成素.④光损伤 40 000 U/L促红细胞生成素组 AG490组:光照12 h,加促红细胞生成素 40 000 U/L及Jak2激酶抑制剂 50 000 U/L.⑤光损伤 40 000 U/L促红细胞生成素组 蛋白激酶B特异性抑制剂组:光照12 h,加促红细胞生成素 40 000 U/L及蛋白激酶B特异性抑制剂100 μmol/L.主要观察指标:采用酶联免疫吸附实验和免疫组织化学法定量检测不同含量促红细胞生成素干预治疗前后视网膜色素上皮细胞半胱天冬酶-3表达的变化.结果:正常对照组半胱天冬酶-3无明显表达;光损伤模型组半胱天冬酶-3表达于视网膜色素上皮细胞核上,呈大量特异性黄色着色;光损伤不同剂量促红细胞生成素组半胱天冬酶-3表达的特异性黄色着色随促红细胞生成素含量增加而减弱,以光损伤 40 000 U/L 促红细胞生成素组最弱光损伤 40 000 U/L促红细胞生成素组 AG490组半胱天冬酶-3呈强阳性表达,光损伤 40 000 U/L促红细胞生成素组 蛋白激酶B特异性抑制剂组半胱天冬酶-3表达仍呈阳性,但较光损伤模型组稍弱.结论:重组人促红细胞生成素可减少视网膜色素上皮细胞的光损伤后半胱天冬酶-3的表达.重组人促红细胞生成素抗光损伤诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡作用机制之一可能是抑制半胱天冬酶-3的表达.     

信号转导分子smad4基因表达抑制体外培养人血管平滑肌细胞的增殖

目的:探讨细胞内转化生长因子β信号通路中信号转导分子Smad4与平滑肌细胞的增殖关系。方法:实验于2003-08/10在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。①取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠,常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0.2和0.05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基,37℃,体积分数0.05CO2进行培养,2.5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色,存活细胞数在98%以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态,抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。②观察项目:转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力的检测应用流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法凋亡检测试剂盒完成。smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因(p16、细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E)和细胞凋亡基因(半胱天冬酶2和半胱天冬酶3)表达变化应用免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测。结果:①转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法测定结果:smad4基因过表达调控人血管平滑肌细胞增殖能力下降DNA合成前期细胞明显增加[(72.33±4.35)%],正常培养细胞DNA合成前期细胞数相对较少[(45.88±1.58)%]。②smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测结果:转染后细胞凋亡能力增加;细胞周期抑制基因p16表达增加,细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E表达下降,凋亡相关基因半胱天冬酶2和半胱天冬酶3表达增加。结论:smad4基因对血管平滑肌细胞增殖能力的抑制作用主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生而实现。转化生长因子β信号传导通路对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用除了能够有效阻滞细胞周期的演进外,还能够诱导细胞凋亡。     

不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切半胱氨酸蛋白酶3的活性及坐骨神经损伤后的表达变化

目的:观察不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况及其在坐骨神经损伤后的表达变化,并分析其与脊髓细胞凋亡的关系。方法:实验于2004-03/09在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择Wistar大鼠324只,成年、幼年、老年大鼠各108只。不同年龄组动物均随机分为对照组和手术组,对照组12只为非手术组;手术组共96只,分为术后1d,3d,1周、2周、3周、4周、5周、6周8个时间组,每组12只。各手术组大鼠均在戊巴比妥钠麻醉后,切除股方肌下缘约6mm的坐骨神经。大鼠脊髓细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测法,原位缺口末端标记阳性细胞及AnnexinⅤ阳性细胞即凋亡细胞;大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况应用免疫组化法检测;大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性应用ActivityAssay试剂盒检测。结果:所有大鼠全部进入结果分析,无脱失。①脊髓细胞凋亡情况的原位缺口末端标记及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测结果:正常成年及老年大鼠未见明显标记的阳性细胞,正常幼年大鼠可见个别阳性标记细胞,坐骨神经损伤诱导脊髓神经细胞凋亡的高发时间为伤后2～4周,老年大鼠细胞凋亡持续时间较长。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。不同年龄大鼠AnnexinⅤ阳性细胞出现时间均早于原位缺口末端标记阳性细胞。②天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性及表达情况比较:幼年正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达及天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性均高于成年及老年大鼠(P<0.01),损伤后各年龄组均有明显变化,幼年正常组损伤后1d天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3开始升高,升高时间早于成年及老年组。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:脊髓细胞凋亡情况与天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性测定结果有较好的相同改变趋势,提示天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标。不同年龄大鼠正常时脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达以其在坐骨神经损伤后的表达变化存在差异,说明针对不同年龄段发生的周围神经损伤,其促进神经再生调控时期不同。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA在淋巴滞留性脑病大鼠脑皮质及海马的表达

目的:探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA在淋巴滞留性脑病大鼠脑皮质及海马中的表达情况及其与神经元凋亡之间的关系。方法:选取成年雄性Wistar大鼠88只,随机分为脑淋巴引流阻断组40只、假手术组40只及正常对照组8只。脑淋巴引流阻断组和假手术组分为术后1,3,5,7,14d5个时间点,每个时间点8只。脑淋巴引流阻断组建立淋巴滞留性脑病动物模型,在损伤后各时间点取颞顶皮质、海马区脑组织。假手术组只分离和暴露淋巴结,但不结扎淋巴管,亦不摘除淋巴结。用半定量反转录-聚合酶链反应方法观察淋巴滞留性脑病大鼠损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA的表达情况。结果:88只大鼠均进入结果分析。①在颞顶皮质,Caspase3mRNA在淋巴阻塞后3d内表达上调,以第1天表达最高,淋巴阻塞后3d内Caspase3mRNA表达比假手术组及对照组高,且有统计学意义(F=29.892,P=0.001<0.01)。淋巴阻塞3d后表达接近正常对照及假手术组。对照组与假手术组之间差异无统计学意义。②在海马,Caspase3mRNA较颞顶皮质表达上调更明显,以第1天表达最高,淋巴阻塞后5d内Caspase-3mRNA表达比假手术组及对照组高,差异有统计学意义(P<0.05),5d后表达接近正常对照及假手术组。结论:在淋巴滞留性脑病大鼠模型中神经元凋亡的发生可能与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的激活有关。     

不同年龄大鼠坐骨神经损伤后睫状神经营养因子对脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达的影响

背景天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3是一种促进细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶,睫状神经营养因子具有多种生物活性,能保护损伤后多种神经元特别是运动神经元,减少神经细胞损伤的发生.目的观察睫状神经营养因子对天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3在坐骨神经损伤后不同年龄大鼠脊髓组织中的表达以及在不同年龄阶段的变化规律和调控特点.设计随机对照动物实验.单位解放军第三军医大学野战外科研究所大坪医院超声科、第五研究室.材料实验于2000-04/2001-12在解放军第三军医大学野战外科研究所完成.Wistar大鼠,体质量30～100 g的幼年大鼠(鼠龄20 d)、200～350 g的成年大鼠(鼠龄4个月)、400～800 g的老年大鼠(鼠龄18～24个月)各270只,雌雄不限,共810只.方法[1]实验动物分组各年龄组大鼠随机分为正常组(n=18)、睫状神经营养因子组(n=126)和生理盐水组(n=126),睫状神经营养因子组和生理盐水组分为术后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周组.[2]动物模型制作睫状神经营养因子组和生理盐水组切除2mm右侧坐骨神经,用硅胶管连接近、远侧神经残端制作神经再生小室,睫状神经营养因子组再生小室内注入25 mg/L重组睫状神经营养因子15 μL,生理盐水组再生小室内注入生理盐水15μL.[3]待测标本的制作及检测分别取各组动物6只,取脊髓L3-5节段,进行天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3免疫组织化学检测、天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性检测和Western blotting检测.主要观察指标[1]免疫组织化学检测的各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达.[2]Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化.[3]天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化.结果810只大鼠进入结果分析.[1]免疫组织化学检测各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达损伤后各年龄组生理盐水组伤侧神经元天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3染色表达增强,伤后2周、4周明显增多、增强,8周、12周较少神经元表达阳性;睫状神经营养因子组损伤后各年龄组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强,伤后2周、4周最为明显.[2]Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化各年龄正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达差异无显著性意义(P＞0.05).与同龄正常组及对侧未伤侧比较,各年龄组生理盐水组及睫状神经营养因子组损伤后1周、2周、4周天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01);睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3幼年于损伤后1周、2周、4周,成年于2周、4周,老年于4周表达较生理盐水组减弱,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01).各组对侧未伤侧与正常组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).[3]天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化幼年、成年、老年生理盐水组伤侧脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性升高,各时相点幼年大鼠天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性高于老年组及成年组(P＜0.05～0.01),幼年、成年、老年组睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性低于生理盐水组(P＜0.05～0.01).损伤后生理盐水组及睫状神经营养因子组对侧未伤侧天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性,除幼年伤后12周较正常组低外(P＜0.05),其余各组与正常组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论坐骨神经损伤后不同鼠龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性增高,外源性睫状神经营养因子可减少脊髓神经元中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性,起保护脊髓神经细胞的作用,其作用在幼年组、成年组及老年组依次减弱.     

人牙冠及根部牙本质内基质金属蛋白酶8,20的测定及分析

背景:基质金属蛋白酶被激活后可降解细胞外基质,其对牙本质胶原的破坏对于牙周病、牙本质龋病、牙髓炎的进展及牙本质黏结的失败有重要影响。目的:检测冠根部牙本质内基质金属蛋白酶的含量及其分布特点。方法:牙本质粉经盐酸胍提取,然后经EDTA循环脱矿,再经盐酸胍提取。采用免疫印迹与免疫酶联吸附反应检测提取物中基质金属蛋白酶8,20的含量,对比二者在牙冠部和牙根部内的分布特点。结果与结论:免疫印迹结果及免疫酶联吸附检测结果均显示,提取物中含有基质金属蛋白酶8,20。未矿化牙本质提取蛋白G1中基质金属蛋白酶8,20含量较低,EDTA反复提取矿化牙本质蛋白E1中含量较高,脱矿后提取蛋白G2中2种基质金属蛋白酶的含量最低。基质金属蛋白酶8,20在牙冠和牙根部表达量基本类似。提示冠根部牙本质中含有基质金属蛋白酶8,20,它们大多存在于矿化牙本质中,其在牙根和牙冠中的含量基本类似。     

一氧化碳中毒大鼠脑红蛋白表达变化及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的：观察急性一氧化碳中毒后脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化及氯化血红素对上述两者表达变化的影响。方法：实验于2005-10／08在华北煤炭医学院解剖学实验室完成。150只雄性SD大鼠随机分成3组，每组50只。①一氧化碳中毒组：大鼠放入染毒罐，静式吸入一氧化碳与空气的混合气60min。造模后分别于1，3，5，7和14d处死，每个时间点10只大鼠。②氯化血红素治疗组：除给予一氧化碳中毒组同样的处理外，于造模后立即注射氯化血红素（30mol／kg，3次／d）直至相应时间点处死，每个时间点10只大鼠。③对照组：不作任何处理，在相应时间点处死。各组大鼠分别行免疫组化染色和免疫蛋白印迹法，观察大鼠脑内的脑红蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化。结果：150只大鼠均进入结果分析。①免疫组化阳性神经细胞数目：一氧化碳中毒组大鼠海马脑红蛋白阳性神经元数目持续下降，至中毒后14d最低，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞逐渐增多，至中毒后5d达高峰，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。经氯化血红素治疗后，与中毒组相比脑红蛋白的表达明显增多，与中毒组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；同时半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的阳性细胞数明显下降，与中毒组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。②免疫蛋白印迹灰度分析：一氧化碳中毒组脑红蛋白的表达持续下降，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达上升，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）；氯化血红素治疗组与中毒组相比，脑红蛋白表达量上升（P〈0．01）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达下降，治疗5d最显著（P〈0．01）。结论：一氧化碳中毒后大鼠脑红蛋白表达呈持续下降；刺激脑红蛋白表达可抑制急性一氧化碳中毒后大鼠脑半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。     

老年性学习记忆减退与大鼠脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5的表达

背景周期素依赖性蛋白激酶5是周期素依赖性蛋白激酶家族的成员之一,脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5mRNA及其蛋白在脑内的表达及分布状况与神经退行性变思维认知学的关系一直被研究者关注.目的探讨大脑发育过程中的周期素依赖性蛋白激酶5对神经系统的发生和退行性变的影响.设计单因素方差分析实验.单位解放军第一军医大学组织学与胚胎学教研室和神经生物学教研室.材料实验在解放军第三军医大学组织学与胚胎学实验室完成.Wistar大鼠胚胎期(E8～E21)、新生期(P0～P15)、幼年期(P16～2个月)、成年期(＞ 2个月)及老年期(＞8个月后)5个阶段25只大鼠,每组5只.方法采用胚胎期至老年期大鼠脑片行原位杂交组织化学和免疫细胞化学染色.主要观察指标不同脑区内周期素依赖性蛋白激酶5mRNA及其蛋白的阳性细胞分布及表达状况.结果25只大鼠全部进入结果分析.①周期素依赖性蛋白激酶5mRNA在大鼠E14～P350整个发育过程中均有表达,成年后趋于稳定;周期素依赖性蛋白激酶5mRNA主要定位于神经元,阳性区域主要分布于大脑皮质、海马、丘脑、下丘脑、小脑及部分神经核团.②出生后周期素依赖性蛋白激酶5表达较强,胚胎及老年鼠表达较弱;阳性区域集中在室周区、海马、小脑及部分神经核团内;老年鼠仅在海马、小脑蒲肯野细胞层内表达.结论脑内周期素依赖性蛋白激酶5的作用贯穿了整个神经发育的各个时期,在新生期、幼年期有较为显著的表达,成年后表达下降,尤以老年期显著.老年大鼠海马内周期素依赖性蛋白激酶5的表达下调可能与老年性学习记忆减退的发生密切相关.     

通心络对大鼠脑缺血再灌注模型微血管细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1表达的影响

背景:现代医学发现通心络制剂除了具有抗凝和抑制血小板聚集作用外,对血管内皮细胞有一定的保护作用。目的:观察中药复方制剂通心络是否影响脑缺血再灌注动物模型黏附分子的表达。设计:随机对照实验。单位:解放军第二军医大学长征医院神经内科。材料:实验于2002-10/2003-01在解放军第二军医大学长征医院神经内科实验室完成。选择雄性SD大鼠25只,随机分为假手术组5只、模型组10只和通心络组10只。方法:线栓法制备大鼠大脑中动脉脑局灶性脑缺血再灌注模型,假手术组除将尼龙线插在颈外动脉接近颈内动脉分叉处外,其余同模型组。通心络组大鼠在缺血再灌注前给予通心络粉剂1.0g/(kg·d),溶在生理盐水中灌胃1周。模型组和假手术组灌胃等剂量生理盐水。各组大鼠麻醉后取脑制备切片,行常规苏木精-伊红染色、免疫组化及原位杂交染色。主要观察指标:①缺血再灌注后细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1阳性微血管表达数目。②缺血再灌注后细胞间黏附分子1mRNA阳性微血管表达数目。结果:①假手术组手术侧大脑半球皮质和基底节区未见细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1蛋白和细胞间黏附分子1mRNA阳性微血管表达。②模型组大鼠缺血2h再灌注6h后,缺血侧大脑细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子-1蛋白表达水平和细胞间黏附分子1mRNA表达水平显著升高。③通心络组缺血侧大脑半球皮质和基底节区蛋白和mRNA阳性微血管数较模型组显著降低犤(10.42±1.98),(12.42±2.14)/高倍视野;(8.54±2.00),(11.12±1.56)/高倍视野犦(P<0.05),血管细胞黏附分子1蛋白阳性微血管表达数目无显著变化(P>0.05)。结论:通心络可以降低大鼠脑缺血再灌注后细胞间黏附分子1的转录和翻译过程,有助于减轻脑缺血后的炎症性损伤过程。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3对缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡的影响

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在正常细胞中以酶原形式存在,受凋亡刺激因素作用后能够被激活从而引起细胞凋亡.目的通过检测脑海马组织胞质S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性及海马区神经元凋亡情况,探讨全脑缺血再灌注后脑海马神经元凋亡与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的关系.设计随机对照实验.单位解放军第三军医大学西南医院急救部.材料实验于1999-01/04在解放军第三军医大学西南医院完成.选取雄性Wistar大鼠182只,随机分为3组假手术组14只,脑缺血再灌注组84只,乙酰天冬氨酰谷氨酰缬氨酰天冬氨酸乙醛(acetyl-asp-glu-valasp-aldehyde,AC-DEVD-CHO)治疗组84只,后两组均设立缺血再灌注8,24,48,72,120,168 h 6个时相点,每个时相点14只大鼠.方法脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组建立大鼠全脑缺血20 min再灌注模型,分别于再灌注后8,24,48,72,120,168 h处死取海马组织;假手术组施行麻醉及手术,但不夹闭颈总动脉和烧灼椎动脉,术后观察72 h后处死取海马组织备检.以单位质量标本于单位时间内裂解产生的氨甲基香豆素量表示标本中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性.各组不同时相点脑组织切片封固后在荧光显微镜下于330～350 nm处观察脑海马细胞凋亡情况.主要观察指标①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化.②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况.③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系.结果实验纳入182只大鼠,脱落14只,共168只大鼠进入结果分析.①各组脑缺血再灌注后不同时相点海马组织S-100中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性变化假手术组术后观察72时为0.与脑缺血再灌注组比较,AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24,48,72,120,168 h均明显降低[(1.71±0.03),(1.22±0.03);(2.77±0.09),(1.59±0.7);(5.54±0.51),(2.3±0.19);(6.28±1.71),(3.43±0.46);(3.11±1.21),(1.73±0.14)nkat/kg;P＜0.05或0.01].②各组脑缺血再灌注后不同时相点海马细胞凋亡的情况每400倍视野下,假手术组术后观察72 h为(1.2±0.4)个.与脑缺血再灌注组比较,AC-DEVD-CHO治疗组于再灌注24,48,72,120,168 h均明显降低[(6.4±1.7),(2.8±0.8);(11.8±1.3),(5.8±1.9);(19.8±3.1),(10.0±1.9);(31.2±5.9),(16.4±2.4);(19.8±2.3),(9.0±2.3)个/400倍视野;P＜均0.01].③半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性与海马区神经元凋亡的关系脑缺血再灌注组、AC-DEVD-CHO治疗组均行直线相关分析,二者的变化呈显著正相关(r分别为0.935 6及0.980 0,P均＜0.01).结论半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活是引起海马神经元调亡的主要因素之一,在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中起着重要作用.     

高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠迟发型脑损伤影响的组织病理学特点

背景:临床上有3%～30%的急性一氧化碳中毒患者会发生一氧化碳中毒后迟发性脑病,出现以痴呆、精神症状和锥体外系症状为主的神经系统症状。目前,其发病机制还不清楚。目的:探讨一氧化碳中毒迟发性脑损伤的病理损伤机制,及高压氧对迟发性脑损伤的影响。设计:随机对照动物实验。单位:解放军第四军医大学航空航天医学系航空卫生教研室。材料:实验于2004-03在解放军第四军医大学航空航天医学系航空病理学和分子生物学实验室进行。取清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只,单纯随机分为3组,正常对照组10只,模型组35只,高压氧组35只,后2组又分为染毒后6h、1,3,5,7,14,21d7个时间点,每个时间点5只。方法:①模型组:将大鼠放入染毒罐中熏吸入一氧化碳与空气的混合气体60min,一氧化碳的体积分数保持在2500×10-6,制备急性CO中毒动物模型。②高压氧组:同模型组造模,染毒后3h开始行高压氧治疗,压力0.2MPa,氧的体积分数保持在0.90以上熏整个过程共115min,染毒后前3d2次/d,之后1次/d,每周休息1d。③正常对照组不干预。主要观察指标:①采用组织病理学、免疫组织化学等方法检测大鼠染毒后各时间点大鼠脑组织病理改变的特点。②通过细胞超微结构观察和原位末端转移酶标记(TUNEL)等方法进行细胞凋亡的检测,观察急性各组大鼠脑神经元凋亡的发生情况。结果:造模后大鼠死亡率约为10%。①模型组大鼠脑内发生广泛的病理损伤,脑皮质、海马、纹状体和小脑等部位神经元出现变性坏死,其中大脑皮质、海马等部位损伤较重。苏木精-伊红、TUNEL染色和电镜观察表明大鼠海马神经元发生凋亡,凋亡神经元从染毒后第3天开始显著增加,第7天达到高峰穴P<0.01雪,以后逐渐减少。②高压氧组:与模型组相比,脑内神经元变性坏死明显减轻,各时间点大鼠海马区损伤均轻于模型组;凋亡神经元数目减少,尤以中毒后5和7d明显(P<0.01)。高压氧促进模型大鼠海马区Bcl-2蛋白表达熏尤以CO暴露后3,5d明显(P<0.01)。结论:①急性一氧化碳中毒大鼠出现广泛的迟发性神经元损伤,表现为迟发的神经元坏死和凋亡。②高压氧治疗可以有效减少变性坏死神经元熏促进凋亡抑制基因bcl-2表达熏从而抑制神经元坏死和凋亡。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景:在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的:探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位:解放军总医院南楼神经科。设计:随机设计。材料:实验于2002-05/2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法:P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液,在胶原被覆的25cm2培养瓶中接种5mL细胞悬液,培养24h后,分别加50μmol/L、100μmol/L奥氮平培养24h,再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35(0.01μmol/L、2μmol/L、20μmol/L)培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡,采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm2培养瓶中的PC12细胞,应用Westernblot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标:细胞存活率的测定,PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果:①细胞存活率比较:淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75%降低到35%;50μmol/L、100μmol/L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响:0.01μmol/L,2μmol/L,20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加,50μmol/L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响:0.001μmol/L、0.01μmol/L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化,50μmol/L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响;2μmol/L、20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高,50μmol/L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论:①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达,提高PC12细胞存活的保护作用。     

siRNA沉默PTTG基因对人胰腺癌细胞PANC-1细胞凋亡的影响

目的研究PTTG基因沉默对胰腺癌细胞凋亡的影响,初步探讨其调控机制。方法利用阳离子脂质体进行基因沉默实验,将PANC-1细胞分为三组（①.未转染PANC-1细胞、②.转染阴性对照siRNA、③转染siRNA-PTTG）,TUNEL染色法检测细胞凋亡;RT-PCR和Western blot技术检测bcl-2,bax基因和蛋白表达;ELISA法检测caspase-3活性。结果组③细胞凋亡明显增多,凋亡率为18.4±2.4%;组①和组②凋亡率分别为7.5±2.0%和6.9±1.1%,差异具有显著性（P〈0.05）;组③bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降,与组①和组②比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;组③、组①和组②间bax mRNA和蛋白表达没有具有统计学差异（P〈0.05）;组③caspase-3活性升高,与组①和组②比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 siRNA-PTTG下调PTTG基因表达导致PANC-1细胞凋亡增加,可能与bcl-2表达下调,caspase-3活性升高有关。     

WCX-2蛋白质芯片对脑损伤大鼠皮质差异蛋白的检测

目的 研究大鼠闭合性颅脑损伤后脑皮质中蛋白表达谱的变化及特点.方法 72只雄性SD大鼠被随机分为假手术组、损伤后4、8、12、24和48 h组;每组8只用于WCX-2蛋白质芯片技术研究,4只用于病理学研究.复制Marmarou落体打击脑损伤动物模型,取大鼠脑皮质行苏木素-伊红(HE)染色进行病理学观察,采用Bradford法检测样本蛋白含量,对样本蛋白行WCX-2蛋白质芯片研究.用蛋白质芯片阅读机对蛋白表达谱进行分析.结果 ①病理学观察显示,各损伤组脑皮质可见不同程度损伤.②WCX-2蛋白质芯片实验发现,与假手术组比较,脑损伤后皮质中有3个蛋白质的表达谱发生改变.其中相对分子质量为5639的差异蛋白在损伤后8 h组表达增加(P＜0.05);相对分子质理为3212的差异蛋白在假手术组、损伤后4、8、12和24 h组几乎不表达,48 h组表达增加(P＜0.05);相对分子质量为7 536的差异蛋白在假手术组、伤后4、8、12和48 h组几毛不表达,24 h组表达增加(P＜0.05).结论 脑损伤可引起脑皮质中蛋白表达谱发生变化.     

An MRI based average macaque monkey stereotaxic atlas and space (MNI monkey space)

In studies of the human brain, a standard stereotaxic space such as the Montreal Neurological Institute (MNI space) is widely used to provide a common reference for the three-dimensional localization of functional activation foci and anatomical structures, enabling the comparison of results obtained across different studies. Here we present a standard macaque monkey brain MRI template that offers a common stereotaxic reference frame to localize anatomical and functional information in an organized and reliable way for comparison across individual monkeys and studies. We have used MRI volumes from a group of 25 normal adult macaque monkeys (18 cynomolgus and 7 rhesus) to create a common standard macaque monkey brain as well as atlases for each of these species separately. In addition, the digital macaque monkey volume was subjected to 3D volumetric analysis and comparison of brain structures between the individual brains and the average atlas. Furthermore, we provide a means of transforming any macaque MRI volume into MNI monkey space coordinates in 3D using simple web based tools. Coordinates in MNI monkey space can also be transformed into the coordinate system of a detailed neuroanatomical paper atlas (Paxinos et al., 2008), enabling researchers to identify and delineate cortical and subcortical structures in their individual macaque monkey brains.     

APP17肽调节胰岛素受体底物1在糖尿病小鼠脑内分布及对脑海马区神经元退行性变的作用

背景:胰岛素在脑内通过胰岛素受体底物发挥作用,APP17肽有神经营养功能,可能通过影响胰岛素受体底物改善胰岛素缺乏引起的糖尿病脑病。目的:制备小鼠糖尿病模型熏观察APP17肽对糖尿病小鼠胰岛素受体底物1的影响。设计:随机对照动物实验。单位:首都医科大学基础医学院病理学教研室,宣武医院脑老化研究室。材料:实验于2003-09/10在首都医科大学基础医学院病理学教研室及宣武医院脑老化研究室完成,选择雄性昆明小鼠18只,随机分为正常对照组、糖尿病组和APP17肽治疗组3组,每组6只。方法:①糖尿病组和APP17肽治疗组小鼠按200mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素熏3d后测尾部非禁食血糖熏大于15mmol/L者被认为糖尿病模型建立。②APP17肽治疗组于糖尿病造模2周后皮下注射APP17肽熏每次0.35μg/只熏1次/d熏共注射2周。正常对照组大鼠不干预。③给链脲佐菌素4周后熏处死动物取脑组织进行胰岛素受体底物1免疫组化染色。主要观察指标:各组小鼠脑胰岛素受体底物1阳性细胞形态及分布。结果:18只小鼠全部进入结果分析。①糖尿病组胰岛素受体底物1阳性反应细胞广泛分布于皮质、海马、丘脑、下丘脑等部位熏而正常对照组及APP17肽治疗组仅在皮质、海马见有阳性反应细胞熏且着色淡。②糖尿病组、正常对照组及APP17肽治疗组脑海马胰岛素受体底物1免疫组化阳性反应细胞数分别为(28.7±1.5),(9.2±1.5),(10.1±1.4)个/10倍物镜,糖尿病组高于其他两组(P<0.001)。结论:糖尿病小鼠脑内多个区域的神经元存在较多的胰岛素受体底物1阳性细胞熏APP17肽能使胰岛素受体底物1阳性反应细胞出现的部位和数量正常化熏从而改善糖尿病小鼠海马神经元的退行性变。     

急性一氧化碳中毒大鼠记忆功能改变与迟发性神经元损伤的相关性

背景:急性CO中毒大鼠可能发生迟发性健忘症,与人急性CO中毒导致的迟发性神经综合征相似,所以实验拟通过对急性CO中毒大鼠的研究来探讨迟发性神经综合征的发病机制。目的:观察急性CO中毒大鼠脑内迟发性神经元损伤和记忆功能的改变,并分析两者之间的关系。设计:随机对照动物实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院急诊科;西安高新医院检验中心;解放军北京解放军空军总医院;解放军第四军医大学航空航天医学系高压氧治疗中心。材料:实验于2005-07/11在解放军第四军医大学航空航天医学系航空病理学和分子生物学实验室进行。取健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只随机分为对照组和染毒组各25只。方法:将染毒组清醒大鼠放入自制染毒罐中,然后向罐内注入体积分数为0.999的CO气体。大鼠在罐内静式吸入CO与空气的混合气体,CO平均体积分数为3.451×10-3,60min后出罐。对照组不干预。主要观察指标:①记忆能力:染毒前和暴露后1,3,5,7d进行大鼠跳台实验,以跳台潜伏期为评价记忆保持巩固能力的指标,跳台潜伏期越短,记忆能力越差。②脑组织病理改变:暴露后1,3,5,7d跳台实验后,两组各处死6只大鼠,取脑,行苏木精-伊红染色以观察脑内病理损伤程度和海马CA1区锥体细胞数。③应用SPSS 10.0软件分析海马CA1区锥体细胞数与组大鼠跳台潜伏期间的关系。结果:48只大鼠进入结果分析。①跳台潜伏期:CO暴露后1,3d,两组相比没有差别,但在CO暴露后第5和7天,染毒组明显短于对照组(P<0.05,0.01)。②海马CA1区锥体细胞数:CO暴露后1d,染毒组与正常对照相比没有明显改变,但是在CO暴露后3,5和7d即明显减少,CO暴露后7d,可以观察到15%的锥体细胞发生死亡。③海马CA1区锥体细胞数减少与染毒组大鼠跳台潜伏期缩短之间有明显的相关性(r=0.270,P<0.01)。具体的主要数据,研究的主要发现(给出统计学显著性检验值)结论:主要结论及其潜在的应用价值。急性CO中毒导致迟发性神经元损伤,迟发性神经元损伤引起迟发性健忘症。