CRISPR/Cas靶向编辑技术在遗传性耳聋研究中的应用前景

摘要耳聋是一种常见的公共健康问题，对人类经济和社会造成极大的损失，60%以上的感音神经性聋由遗传因素导致，遗传性耳聋研究一直是研究领域的热点，本文针对新型CRISPR/Cas靶向编辑技术的研究现状，阐述该技术对遗传性耳聋研究的价值，并探讨其未来的应用前景。     

单碱基编辑工具及在基因治疗中的应用及前景

随着CRISPR/Cas9基因编辑工具效率的提高,其应用范围逐渐从实验室扩展到临床,但CRISPR/Cas9进行基因修改的效率还不够高。单碱基编辑工具直接将一种碱基对永久转变成另一种碱基对,是一种不需要切开双链DNA的化学修复方法,可以高效地进行基因修复。尽管单碱基编辑工具研发时间不长,但是已经在基因编辑领域得到了广泛的应用,包括在小鼠内耳的基因编辑。单碱基编辑工具将是开展耳聋基因治疗的有效工具。     

全外显子组测序技术及其在遗传性耳聋研究中的应用

近年来,全外显子组测序技术迅猛发展,为遗传疾病的基因研究带来了新的机遇,受到遗传学多个领域的重视与应用,其在遗传性耳聋的应用也日益受到关注。该技术先应用靶向富集技术捕获基因组的外显子区域,再通过高通量测序获得编码区序列遗传信息。本文主要介绍全外显子组测序的技术路线及在遗传性耳聋中的应用与研究成果。     

一非综合征性母系遗传聋大家系线粒体基因组基因突变的研究

文献报道 ,线粒体 DNA (mt DNA) 1 2 Sr RNA基因 A1 555G点突变及 t RNA Ser(UCN) 基因A7445G突变是导致非综合征性母系遗传聋的分子遗传学基础。近期 ,我们在对以往报道的江苏省淮阴县方氏遗传聋大家系进行系谱复核和听力学抽样复查后 ,修正了以前所持常染色体显性遗传聋的观点 ,将其遗传模式确定为母系遗传——线粒体遗传。为进一步寻找与该家系耳聋表型相应的 mt D-NA突变 ,本文采用 PCR、PCR- RFLP(限制性内切酶消化 )、PCR- SSCP(单链构象多态性分析 )技术 ,对文献报告的上述两个 mt DNA位点进行了系统研究 ,报告如…     

遗传性耳聋产前诊断的研究进展

随着分子生物学的发展，耳聋分子遗传学取得了重大突破，借助分子遗传学技术在聋人群体及遗传性耳聋家庭中开展产前诊断可减少聋儿的出生。新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）可以通过检测孕妇外周血中胎儿游离DNA鉴定胎儿基因型，避免了传统有创产前诊断在取材时所带来的创伤。胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）技术的应用可以减少常规产前诊断可能面临的选择性流产带来的巨大身心伤害。本文总结并分析了遗传性耳聋产前诊断的研究现状和进展。     

基因拷贝数变异在遗传性耳聋研究中的进展

耳聋是最常见的严重影响言语交流的残疾之一,每年至少有一半的新生聋儿是由于遗传缺陷引起的。引起耳聋的致病基因和突变种类众多,其中,基因拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)被确认为是广泛存在于人类基因组DNA的重要变异形式,并且可以通过干扰基因表达来调控表型,是影响人类某些疾病的重要因素,其在遗传性耳聋致病机制中也起到重要作用。随着基因组测序技术的飞速发展,越来越多的致病性CNVs被发现、鉴定及定位。本文就目前CNVs与遗传性耳聋的关系研究作一综述,详细阐述CNVs在遗传性耳聋分子诊断中的重要作用。     

一个非综合征型聋家系MITF基因致病性新突变

目的 研究一个非综合征型聋家系的致病基因突变.方法 通过家系调查、临床检查和遗传学特征分析,对一个非综合征型聋家系的临床表型及致病原因进行分析,提取家系成员的外周血DNA,应用遗传性耳聋基因芯片结合耳聋基因靶向测序筛选致病基因,然后利用Sanger测序对发现的致病基因位点进行验证,分析该突变位点在各物种中的保守性及该突...     

线粒体DNA A1555G和G7444A双重突变导致的非综合征型遗传性耳聋

目的通过对一个母系遗传非综合征型耳聋家系进行线粒体DNAl2SrRNA及COI/tRNAS Ser(UCN)基因突变分析,研究线粒体DNA突变与遗传性耳聋的相关性.方法收集母系遗传耳聋家系12人的临床资料和外周静脉血标本,纯音听力测试明确感音神经性耳聋诊断,从白细胞中提取DNA,聚合酶链反应扩增线粒体DNA目的片段,对扩增片段进行DNA直接测序.结果测序结果表明,此家系线粒体DNA 12SrRNA基因中存在着A1555G突变,COI/tRNA Ser(UCN)基因中存在着G7444A突变.结论在该非综合征型遗传性耳聋家系中,线粒体DNA A1555G和G7444A突变可能共同参与了听力损害的过程.     

表观遗传学在慢性鼻窦炎伴鼻息肉发病机制中的作用

慢性鼻窦炎伴鼻息肉其确切的发病机制尚未完全明确。表观遗传学(Epigenetics)主要指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控等。就相关基因的表观遗传学修饰及其引起的相应细胞因子和蛋白质等的表达改变在CRS发病机制中的作用作一综述,从全新的角度认识CRS,为明确其发病过程、探究治疗方法提供新的方向。     

非综合征型耳聋家系的遗传学特征分析

目的分析一个常染色体显性遗传性耳聋家系临床及遗传学表型,并筛查常见耳聋致病基因。方法通过调查问卷、体格检查、听力学检测,完成该湖南籍耳聋家系的临床资料采集,绘制家系遗传图谱,分析其听力学及遗传学特征,对最常见的GJB2,SLC26A4和12S r RNA共3个耳聋基因八个位点以及线粒体DNA全组序列进行初步筛查。结果该家系共5代,现存家系成员35人,耳聋患者10人,除两人发病较晚,余均为自幼发病,听力曲线呈盆覆型,造成部分言语功能障碍,进展性加重,起初为中频受累,随着年龄的增长,以后逐渐累积高低频,表现为全频听力损失,发展为重度-极重度耳聋。对候选致病基因突变筛查,未发现致病突变。结论该耳聋家系符合常染色体显性遗传规律,进一步将通过新一代测序全外显子测序技术对其致病基因进行探索。     

常染色体隐性遗传耳聋家系的诊断和产前诊断

目的对常染色体隐性遗传耳聋家系进行基因检测与产前分子诊断。方法收集先证者临床及家系资料,应用聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶法检测,并用直接测序技术确认,对该家系成员的GJB2基因外显子进行序列分析。并运用STR位点分析方法排除产前诊断中母体基因组DNA的污染。结果家系1先证者GJB2基因分型为235delC/299-300delAT复合杂合突变,系重度感音神经性耳聋,父亲和母亲分别为299-300delAT和235delC杂合突变携带者,临床表型均正常。家系2先证者系235delC纯合突变,其父母均为235delC杂合突变携带者,具有正常听力表型。产前诊断结果显示,家系1和家系2胎儿GJB2基因分型分别为299-300delAT杂合突变和235delC杂合突变。结论 GJB2基因235delC纯合性突变和235delC/299-300delAT复合杂合突变均为耳聋致病突变,结合运用STR位点分析方法有助于在产前诊断中排除母体DNA对胎儿DNA的污染,产前诊断和早期干预能避免耳聋患儿的出生。     

NELL2a在斑马鱼神经丘的表达及其突变模型构建北大核心CSCD

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NELL2a基因突变模型,为探究NELL2a在非综合型听神经病谱系障碍(auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD)发生发展中的作用奠定基础。方法通过原位杂交技术,证实NELL2a基因在侧线神经丘表达,针对斑马鱼NELL2a基因,设计gRNA靶位点,体外合成gRNA和Cas9 RNA,在胚胎发育的单细胞期,通过显微注射的方法,将其注射入胚胎内。待仔鱼发育至一定时期,通过尾鳍鉴定,进而获得NELL2a F0代,后续通过F0代侧交,获得F1代杂合子,通过F1代自交获得F2代纯合子。通过听觉诱发电位(AEP)检测F2代纯合子的听力状态。结果通过测序证明已经获得NELL2a(ΔGC)纯合子,Nell2a^-/-斑马鱼在600、800、1000和2000 Hz声刺激频率的AEP阈值均显著高于野生型斑马鱼。结论NELL2a表达于斑马鱼侧线神经丘,推测其对神经丘毛细胞的功能起着重要作用,具体机制有待进一步研究。     

人胆脂瘤角化细胞的Fas/APO-1蛋白表达与细胞凋亡

Fas/APO-1是一种细胞表面蛋白,也是肿瘤坏死因子受体,其与Fas配体结合可导致细胞凋亡。对10例中耳手术中取得的胆脂瘤和耳后皮肤进行了研究。用原位末端脱氧核苷转移酶(TAT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色技术和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。用免疫印迹和免疫组化方法检测Fas/APO-1蛋白的表达形式。结果发现,原位TUNEL染色在9/10例胆脂瘤上皮的基底层以上有较多的阳性细胞核,而在耳后皮肤仅有少数阳性细胞出现在颗粒细胞层。胆脂瘤上皮基因组DNA凝胶电泳显示典型的“梯形分布”,其中Fas/APO-1蛋白的分子量为44k…     

USH1C基因内含子新突变导致一耳聋家系的研究

目的 对一个耳聋家系,应用高通量测序技术、Minigene实验,对其听力损失病因及分子生物学致病原因进行探究。方法 首先采集先证者及家系成员的病史、绘制家系图,并进行听力学评估及耳部影像学检查。获取该家系2代3人外周血提取基因组DNA,对患儿采用高通量测序方法对406个耳聋基因编码区的全部外显子及部分内含子和启动子进行检测,筛选疑似致病突变,针对变异位点对家系成员进行Sanger测序验证,应用Minigene实验进行验证。结果 患儿表现为双侧极重度聋,高通量测序结果为USH1C纯合突变c.388-1G>A,导致氨基酸发生剪接突变,根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南,该变异初步判定为疑似致病性变异;Sanger测序验证其父母均为该位点的杂合携带者。Minigene实验表明该位点突变会导致m RNA异常剪接。结论 本家系中发现的USH1C基因内含子新突变为致病性突变,该突变导致先证者耳聋。     

头颈副神经节瘤表观遗传学研究进展

头颈部副神经节瘤是一种无内分泌功能的副交感神经肿瘤,多数为良性肿瘤,常与SDHx基因突变有关。表观遗传学主要机制为DNA甲基化及组蛋白甲基化,参与抑癌基因表达调控,在副神经节瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。表观遗传对基因表达的调控不涉及DNA序列改变,DNA甲基化与组蛋白修饰都是可逆转过程,靶向干预相关酶的药物今后有望成为新的有效的治疗手段。     

遗传性耳聋家系线粒体DNA 961delT/insC(n)突变的致病性分析

目的 探讨线粒体DNA 961delT/insC(n)突变与氨基甙类药物性耳聋的相关性.方法 对一个耳聋家系11个成员采集氨基甙类抗生素用药史、进行听力学检查、表型分析,采集外周静脉血样本,从白细胞中提取DNA,用聚合酶链反应扩增线粒体DNA(mtDNA)全序列,对扩增片段进行DNA测序,对发现的基因突变与耳聋表型进行分离分析.结果 参与研究的所有9例母系成员均检出mtDNA 961delT/insC(n)突变.有明确氨基甙类抗生素用药史的4例中只有2例耳聋患者,其中1例为用药之前出现的先天性聋,另1例为用药后38年出现的轻度耳聋.突变不与耳聋共分离.结论 本研究不支持mtDNA 961de1T/insC(n)突变是该家系耳聋的致病突变,mtDNA 961位点附近可能是一个多变异的区域,mtDNA 961delT/insC(n)可能是一个与氨基甙类药物性耳聋不明确相关的多态.     

非综合征型耳聋患者mtDNA A1555G异质性突变比例与临床表型的关系

目的定量检测非综合征型耳聋患者线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)1555突变型/野生型的拷贝数,探讨突变型/野生型比例与临床表型之间的关系。方法建立实时定量PCR技术和扩增阻滞突变系统(Real-time quantitative PCR和Amplification refractory mutation system,RT-ARMS-qPCR系统)对含突变型和野生型mtDNA 1555位点的拷贝数进行定量检测并计算比例。共检测散发组12例、家系组7例异质性突变患者,结合耳聋患者的临床资料,分析突变型与野生型的比例与耳聋严重程度的关系。结果散发组mtDNA A1555G异质性突变的患者中,突变型mtDNA所占的比例与耳聋轻重程度相关(r=0.771,P=0.003);家系组患者中,突变型mtD-NA所占的比例亦与耳聋轻重程度相关(r=0.850,P=0.015)。结论突变型mtDNA占所有mtDNA的比例与耳聋的严重程度密切相关,是非综合征型耳聋临床表型多样性的分子基础。     

与线粒体基因突变相关的耳聋

有关感音神经性耳聋 (sensorineural hearingloss,SNHL)与线粒体基因 (mitochondrial DNA,mt DNA)突变相关性的认识 ,是耳聋基因学领域一个重大的成就。现已证实 ,具有母系遗传倾向的mt DNA突变确与各种 SNHL相关。本文对有关mt DNA突变所致的伴有或不伴有综合征的各种SNHL的发病特点 ,以及已知的分子学基础作一综述。1 　 线粒体基因及其遗传特点人类每个线粒体平均包含 6个闭环式结构的mt DNA,每个 mt DNA由 1 6569个碱基对组成 ,编码呼吸链中的 1 3种结构基因及 2种 r RNA和 2 2种 t RNA。这 1 3种结构基因与核 DNA编码…     

OTOGL复合杂合突变致常染色体隐性遗传非综合征型聋的遗传及听力表型分析

目的 探寻1个中国汉族非综合征型遗传性聋家系的致病原因。方法 收集该家系临床资料，采集静脉血后抽提DNA,通过Sanger测序对三大常见耳聋基因(GJB2、SLC26A4、线粒体DNA 12SrRNA)全序列进行筛查以排除致病突变，通过靶向捕获二代测序对目前所有已知耳聋基因进行检测并寻找该患者的可疑致病基因，并通过Sanger测序对变异进行验证。结果 该家系中先证者听力表型为中度听力障碍，其姐姐为中重度听力障碍，其父母听力正常，对先证者进行三大耳聋基因筛查未见可疑致病突变，通过靶向捕获二代测序及Sanger测序验证发现OTOGL基因截短类型的复合杂合突变是该家系高度可能的致病原因，先证者及其姐姐均携带OTOGL基因c.2833C>T(p.Arg945*)/c.6467C>A(p.Ser2156*)复合杂合突变，分别来自其父母。根据美国医学遗传与基因组学会(American College of medical genetics and genomics, ACMG)遗传变异分类标准与指南，c.2833C>T(p.Arg945*)与c.6467C>A(p.Ser2...     

线粒体DNA突变与遗传性耳聋

耳聋是耳鼻咽喉科的常见病．严重影响人们的健康和生活质量．其中相当一部分由遗传因素引起。关于遗传性耳聋的总发病率在我国还没有可靠的统计资料。在发达国家，60％的耳聋因遗传缺陷引起。新生儿中听力障碍群体发病率约为1/1000．其中一半是遗传因素所致。随着分子生物学技术在耳聋研究中的应用．发现线粒体DNA(mitochondrial DNA．mtDNA)突变与遗传性耳聋有密切关系。