输卵管妊娠绒毛滋养层细胞的体外培养与鉴定

目的建立输卵管妊娠绒毛滋养层细胞有效的培养与鉴定方法。方法通过胰酶消化法培养滋养细胞,差异贴壁法分离滋养细胞,通过光镜、电镜和免疫荧光细胞化学染色法对所培养的细胞进行形态和细胞骨架评价。结果倒置显微镜下可见细胞呈上皮样细胞形态;透射电镜、扫描电镜观察,细胞的超微结构具有典型滋养层细胞结构;直接免疫荧光双标记染色检测到角蛋白染色为阳性,波形蛋白为阴性。结论该法切实可行,可获得合乎实验要求的输卵管妊娠滋养细胞,可供后续实验研究。     

人早孕流产蜕膜细胞的原代培养研究

目的建立纯度较高的适于实验研究的人蜕膜细胞。方法胶原酶I消化法培养人蜕膜细胞,光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞内部结构,间接免疫染色进行细胞鉴定。结果倒置显微镜下,可见细胞呈不规则多角形,呈片状铺展生长,核大卵圆形,胞质透明、糖原丰富,内质网扩张明显。免疫组化法检测细胞功能性指标胎盘催乳素,有99%培养的蜕膜细胞呈阳性。结论该法简便易行,可获得合乎实验要求的人蜕膜细胞,为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

胎盘Hofbauer细胞的体外培养和鉴定

目的 通过对早孕胎盘绒毛膜Hofbauer细胞的分离,纯化和培养,寻找一种稳定、简便的,可获得较高纯度Hofbauer细胞的培养方法,以满足后续实验要求.方法 通过胰酶/胶原酶联合消化法对妊娠6～10周绒毛组织进行消化,获得单细胞悬液,根据不同细胞贴壁时间的差异,对Hofbauer细胞进行纯化,并通过免疫组织化学法对Hofbauer细胞进行鉴定.结果 获得了较高纯度的胎盘Hofbauer细胞,免疫组化法鉴定CD68阳性,细胞生长状态良好.结论 利用胰酶/胶原酶联合消化法及差异贴壁法可以获得满意的人胎盘Hofbauer细胞.     

体外感染巨细胞病毒的胎盘滋养层细胞超微结构的变化

目的:探讨巨细胞病毒(CMV)对胎盘滋养层细胞超微结构的影响。方法:取无菌胎盘组织分离提纯滋养层细胞,以含20%感染CMV患者血清的培养液感染滋养层细胞(实验组),同时用含20%正常人血清的培养液感染滋养层细胞作为阴性对照(对照组),以透射电子显微镜观察其超微结构变化。结果:实验组滋养层细胞肿胀,可见"猫头鹰眼细胞",细胞内观察到许多病毒颗粒样结构;溶酶体大量增生,可见到类似病毒核衣壳样小空泡;粗面内质网和高尔基复合体增生,线粒体增大。结论:CMV可通过感染胎盘滋养层细胞进而使胎儿发生宫内感染;CMV使胎盘滋养层细胞超微结构发生改变,影响其在母一胎界面的免疫调节,丧失了对胚胎的免疫保护。     

体外感染巨细胞病毒的胎盘滋养层细胞超微结构的变化

目的探讨巨细胞病毒(CMV)对胎盘滋养层细胞超微结构的影响.方法取无菌胎盘组织分离提纯滋养层细胞,以含20%感染CMV患者血清的培养液感染滋养层细胞(实验组),同时用含20%正常人血清的培养液感染滋养层细胞作为阴性对照(对照组),以透射电子显微镜观察其超微结构变化.结果实验组滋养层细胞肿胀,可见"猫头鹰眼细胞",细胞内观察到许多病毒颗粒样结构;溶酶体大量增生,可见到类似病毒核衣壳样小空泡;粗面内质网和高尔基复合体增生,线粒体增大.结论CMV可通过感染胎盘滋养层细胞进而使胎儿发生宫内感染;CMV使胎盘滋养层细胞超微结构发生改变,影响其在母-胎界面的免疫调节,丧失了对胚胎的免疫保护.     

人胎盘组织和滋养层细胞膜联素V的检测

目的检测膜联素V(AnnexinV)在人胎盘组织的表达及其分布,探讨乙肝病毒(HepatitisBVirus,HBV)感染胎盘细胞的可能方式.方法收集血清学HBsAg阳性孕妇足月胎盘组织39例、血清学HBsAg阴性孕妇足月胎盘组织4例,将培养的滋养层细胞制成细胞爬片,用免疫组化方法检测胎盘组织和滋养层细胞中的Annexin V.随机选取7例胎盘组织采用免疫荧光标记方法结合激光共聚焦技术对Annexin V进行重测.结果Annexin V存在于人类胎盘组织中,位于滋养层细胞、间质细胞及绒毛毛细血管内皮细胞的胞浆中.结论胎盘中含有丰富的AnnexinV,推测其可能是乙肝病毒进入滋养层细胞并感染胎儿的潜在受体.     

人胎盘滋养细胞分离培养及HPV6感染研究

目的研究人胎盘滋养细胞分离纯化培养及人乳头瘤病毒6型(HPV6)感染后其生物学特性的变化。方法用酶消化法和Percoll密度梯度离心分离培养人胎盘滋养细胞,免疫细胞组化染色鉴定其纯度,以HPV6感染后检测滋养细胞凋亡率。结果获得纯化的滋养细胞,HPV6感染48h后检测其凋亡率为(38.26±6.38)%。结论人乳头瘤病毒6型能感染滋养细胞并诱导其凋亡。     

人膜联蛋白Ⅴ在乙肝病毒感染胎盘中的作用研究

目的 检测人膜联蛋白Ⅴ在乙肝病毒感染胎盘中的表达,探讨其在乙肝宫内感染中的意义.方法 用SP法检测30例HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘和20例乙型肝炎病毒血清标志物阴性的正常足月胎盘人膜联蛋白Ⅴ的表达、分布,并进行定量分析.结果 实验组和对照组标本的绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞均可见棕黄色人膜联蛋白Ⅴ表达的阳性信号;乙型肝炎病毒感染胎盘中人膜联蛋白Ⅴ的表达由母面绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞至胎儿面绒毛毛细血管内皮细胞逐层递减;乙型肝炎病毒感染组和正常组人膜联蛋白Ⅴ比较,前者的平均灰度比后者明显增高,具有显著性差异(t=-2.558,P<0.05).结论 乙型肝炎病毒感染的胎盘组织人膜联蛋白Ⅴ的表达上调,人膜联蛋白Ⅴ可能作为受体介导了乙型肝炎病毒与胎盘组织细胞的内吞和摄入等过程,从而导致了乙型肝炎病毒对胎盘的感染.     

正常妊娠与子痫前期的免疫调节

妊娠可看作是一种成功的同种半异体移植.在这个过程中,母体免疫系统存在特殊的免疫调节,使胎儿不被排斥.妊娠早期人类白细胞抗原G,E,C(HLA-G,HLA-E,HLA-C)在绒毛外细胞滋养层表达,作用于免疫细胞,调节母体免疫.妊娠晚期胎盘产生细胞因子调节细胞免疫和体液免疫平衡,维持正常妊娠.如这种调节机制异常,会导致病理性妊娠,如子痫前期.对正常妊娠及子痫前期的免疫调节进行综述.     

大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离的实验研究

目的建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)增殖模型,探讨体外分离HOC的方法。方法选择81只体重(200±20)g的雄性Wistar大鼠,随机分为对照组和模型组。采用2_乙酰氨基芴 2/3肝切除术的方法(2_acetylaminofluorene twothirdspartialhepatectomy,2_AAF 2/3PH)建立HOC增殖模型。使用不同剂量的2_AAF通过胃管灌喂,5d后行肝2/3切除,术后第二天各组按设定剂量继续灌喂,并于术后4h、4d、8d、12d、16d不同的时间点取肝组织,行免疫组化染色检查其增生程度。取HOC增生最明显的大鼠组,利用改进的Selen胶原酶和Percoll密度梯度离心分离出大鼠HOC,在倒置显微镜、电镜下观察细胞特点。结果2_AAF 2/3PH的方法能在不同时间点激活不同数量的大鼠HOC,其中以灌喂8d最为明显,而对照组未见HOC增殖。分离所得大鼠HOC的平均收获量为(2·0±0·32)×106,Typanblue拒染试验细胞活性率(89·20±2·10)%。结论2_AAF 2/3PH是较理想的HOC增殖模型。胶原酶消化法与Percoll密度梯度离心能有效地分离HOC,是分离成体肝干细胞有效的方法。     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

水通道蛋白2在人胎膜中的表达及意义

目的:通过检测水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)是否在人胎盘和胎膜组织中表达,探讨AQP2在羊水平衡中的意义。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术对5例足月正常分娩的胎盘和胎膜组织样本进行AQP2的检测。结果:RT-PCR显示AQP2mRNA水平在胎膜组织中有表达;免疫组化显示AQP2阳性着色主要分布于羊膜上皮细胞的胞膜和平滑绒毛膜滋养细胞。结论:AQP2在人胎膜组织中表达,提示其可能在羊水平衡的调节中发挥作用。     

人胎盘糖皮质激素受体与宫缩的关系

目的:检测人胎盘组织中糖皮质激素受体水平,探讨其与妊娠子宫收缩的关系。方法:收集2010年1～8月在遵义医学院附属医院产科住院的60例单胎、足月妊娠、初产妇为研究对象,根据宫缩情况分为3组,每组各20例。取产后胎盘母体面(脐带附着处)约2 cm×2 cm×1 cm组织,标本经处理后采用免疫组化Envision法检测胎盘中糖皮质激素受体表达水平,并进行图像分析。结果:①免疫组化结果显示:宫缩正常组人胎盘滋养叶细胞胞浆中糖皮质激素受体强阳性表达,为黄色或棕黄色染色,原发性宫缩乏力组与无宫缩组人胎盘滋养叶细胞胞浆透明,糖皮质激素受体几乎无表达。②宫缩正常组人糖皮质激素受体阳性颗粒平均光密度值为0.335±0.119,宫缩乏力组为0.185±0.074,无宫缩组为0.182±0.077,3组值两两比较,宫缩正常组比原发性宫缩乏力组及无宫缩组高,P<0.05,差异有统计学意义,原发性宫缩乏力组与无宫缩组比较,P>0.05,差异无统计学意义。③宫缩正常组20例,糖皮质激素受体阳性表达16例,阳性表达率为80.0%;原发性宫缩乏力组中阳性表达2例,阳性表达率为10.0%;无宫缩组阳性表达1例,阳性表达率为5.0%,宫缩正常组与原发性宫缩乏力组及无宫缩组比较,P<0.05,差异均有统计学意义,卡方值分别为χ2=19.798,χ2=23.018,原发性宫缩乏力组与无宫缩组比较,P>0.05,差异无统计学意义。结论:糖皮质激素受体在人胎盘中的表达水平与宫缩强度有密切关系,可能与早产及产力异常的发生有关。     

20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养

目的建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法。方法采用0．25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价;用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度。结果联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％。结论联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

Cytotrophoblast cells from human first-trimester placental villi: isolation,characterization, cultivation and research applications

INTRODUCTION: Successful implantation and placentation are essential for the normal intrauterine development of the fetus. Trophoblast cell proliferation, differentiation, invasive behaviour and interaction with the maternal immune system are known to have an impact on these processes. Trophoblast cells do not only physically anchor the developing fetus to the uterus, but they give rise to the syncytiotrophoblast. This is the principal endocrine component of the placenta, and participates in essential metabolic processes and in the defence against transplacentally transmitted infections. Therefore, placental trophoblasts play an important role in the establishment and maintenance of pregnancy. AIM OF THE STUDY: The authors summarize their experience with the isolation, characterization and culture of cytotrophoblast cells from first-trimester human placentae. MATERIALS AND METHODS: The simultaneous preparation of highly enriched human placental trophoblast populations from first-trimester placental villi (6-12 weeks of gestation) by sequential trypsinization, Percoll gradient centrifugation, and negative selection with anti-CD45 or HLA-ABC and HLA-DP, DQ, DR immunomagnetic separation is described. Characterization of freshly isolated and cultured cytotrophoblast cells has been performed by immunohistochemistry, immunofluorescent staining, measurement of hCG production and analysis of matrix metalloproteinase production by substrate gel zymography. RESULTS AND CONCLUSION: On the basis of immunohistochemical and functional data the isolated cells proved to be cytotrophoblasts. This method of isolation and cultivation should facilitate in vitro studies of trophoblast differentiation, invasion, endocrine function, virus interaction, and immunology.     

子痫前期患者胎盘和母血中脂联素及抵抗素mRNA的表达及意义

目的:检测脂联素(Ad iponectin)和抵抗素(Resistin)mRNA在子痫前期患者胎盘组织和母血中的表达水平,探讨其在子痫前期发生、发展中的作用及相关性。方法:用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测40例子痫前期患者(20例轻度子痫前期患者和20例重度子痫前期患者)和30例正常妊娠妇女的胎盘和血液中脂联素和抵抗素mRNA的表达水平。结果:脂联素和抵抗素在子痫前期患者和正常对照组的胎盘和母血中均有表达。①脂联素在重度子痫前期胎盘和母血中的表达水平分别为0.403±0.145和0.113±0.014,均低于正常对照组的0.838±0.324和0.503±0.033,两组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);在轻度子痫前期胎盘和母血中的表达水平分别为0.659±0.018和0.441±0.089,均低于正常对照组的0.838±0.324和0.503±0.033,两组分别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②抵抗素在重度子痫前期胎盘和母血中的表达水平分别为0.104±0.067和0.047±0.009,均低于正常对照组的0.427±0.023和0.230±0.189,两组分别比较,差异有统计学意义(P<0.05);在轻度子痫前期胎盘和母血中的表达水平分别0.301±0.109和0.148±0.063,均低于正常对照组的0.427±0.023和0.230±0.189,两组分别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。③脂联素和抵抗素在子痫前期胎盘和血液中的表达水平均呈正相关关系(r=0.417,r=0.302,P均<0.05)。结论:胎盘组织和母血中脂联素和抵抗素的低表达可能与子痫前期发病有关,参与了子痫前期的病理生理过程。     

胎盘组织KiSS-1及metastin表达在早发重度子痫前期发病中的作用及其与围生结局的相关研究

目的:探讨胎盘组织中KiSS-1及其蛋白肽metastin表达在早发重度子痫前期发病中的作用及其与围生结局的相关性。方法:采用RT-PCR、westernblot、免疫组化方法检测57例子痫前期患者(轻度15例和重度42例,其中早发重度12例,晚发重度30例)和30例正常晚期妊娠者胎盘组织中KiSS-1及其蛋白的表达水平和定位,并与围生结局进行相关性分析。结果:子痫前期胎盘组织中KiSS-1及蛋白肽metastin的表达定位与正常晚期胎盘组织相似,主要表达在绒毛的合体滋养细胞和细胞滋养细胞。子痫前期组胎盘组织中KiSS-1mRNA及其蛋白表达分别为(1.73±0.24)和(78.41±7.96)μg/100μg总蛋白,显著高于正常晚期妊娠组(P<0.01、P<0.01),以重度子痫前期组尤为显著,早发重度子痫前期组显著高于晚发重度子痫前期组。与正常晚期妊娠组相比,子痫前期组metastin平均光密度(0.64±0.02)显著增高(P<0.01),随着病情的加重而逐渐增高,早发重度子痫前期组显著高于晚发重度子痫前期组(P<0.01)。随着新生儿窒息程度的加重,KiSS-1mRNA及其蛋白表达水平呈升高趋势(P<0.05、P<0.05),且与窒息程度呈明显正相关,r分别为0.463(P=0.016)和0.587(P=0.027)。KiSS-1mRNA及其蛋白表达水平与新生儿体重呈显著负相关,r分别为-0.764(P=0.000)和-0.899(P=0.000)。结论:子痫前期存在KiSS-1基因及其表达增强,且早发重度子痫前期组表达显著高于晚发重度子痫前期组,与滋养细胞侵润能力下降和新生儿预后密切相关,其异常表达可能是早发重度子痫前期发病的主要原因之一且与围生结局密切相关。     

Netrin-1在胎儿生长受限及重度子痫前期胎盘中的表达

目的:通过检测Netrin-I在正常足月妊娠、重度子痫前期、胎儿生长受限及重度子痫前期合并胎儿生长受限胎盘中的定位及表达,探讨Netrin-1与妊娠过程中胎盘形成及胎儿生长的关系。方法:分别采用免疫组织化学染色法、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR)及免疫印迹法(Western blot)检测24例正常足月妊娠、18例重度子痫前期、15例胎儿生长受限及18例重度子痫前期合并胎儿生长受限胎盘中Netrin-1蛋白定位、含量及mRNA的表达水平。结果:Netrin-1定位于细胞滋养细胞及合体滋养细胞的胞浆。real-time PCR及免疫印迹法结果显示,与正常足月胎盘相比,重度子痫前期胎盘Netrin-1mRNA及蛋白水平稍有下降,但无统计学意义(P>0.05),但在胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组中Netrin-1表达水平显著降低(P<0.01)。结论:孕期滋养细胞是Netrin-1的重要来源之一。Netrin-1参与了妊娠期胎盘形成的调控,可能在胎儿生长过程中发挥重要作用。