基于SNP位点鉴定藏菖蒲及其近缘种

目的：采用DNA条形码技术和SNPs技术,快速准确鉴定藏菖蒲及其近缘种、混伪品。方法：提取藏菖蒲及其近缘种的全基因组DNA,扩增内部第二转录间隔区（internal transcribed spacer 2,ITS2）并测序,测序结果用CodonCode Aligner 4.2.7拼接;基于隐马尔科夫模型（Hidden Markov Model,HMM）注释ITS2,采用MEGA5.1进行序列比对,SNP位点查找、种内主导变异分析和系统进化树构建。结果：通过对藏菖蒲同属近缘种的96条ITS2序列进行分析,发现第23位和212位存在稳定的SNP位点,可准确鉴定藏菖蒲;藏菖蒲ITS2序列的种内变异很小,仅在158位存在一个多拷贝位点。结论：该方法快速、准确、特异性强,可用于藏菖蒲的鉴定。     

基于ITS2条形码SNPs的人参和西洋参PCR-SSCP分子鉴别研究

目的:依据人参和西洋参ITS2条形码的专属性SNP鉴别位点,建立利用PCR-SSCP技术鉴别人参和西洋参的方法.方法:查找GenBank上已收录的人参和西洋参ITS2序列,进行比对分析,筛选人参和西洋参ITS2序列的专属性SNP鉴别位点,据此设计引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对11个人参样品和10个西洋参样品进行分析,对PCR产物进行测序验证.结果:人参和西洋参样品的PCR-SSCP谱带与各自的对照药材谱带一致,人参和西洋参的PCR-SSCP谱带有显著差异;PCR-SSCP鉴别结果和经测序鉴别结果一致.结论:和测序法相比,PCR-SSCP方法快速、准确,可用于人参和西洋参药材的鉴定.     

基于SNP位点鉴定砂仁药材物种

目的：为建立基于单核苷酸多态性（SNP）技术鉴别砂仁3 个基原（阳春砂Amomum villosum、海南砂Amomum longiligulare、绿壳砂Amomum villosum var.xanthioides）的方法,对这3 个种共计60 份材料ITS2 序列进行分析比较。方法：将实验所得砂仁ITS2 序列,应用CodonCode Aligner 软件进行序列拼接比对。用MEGA 5.0 导出各序列变异位点,并对变异位点进行分析。为验证结果准确性,下载砂仁3 个基原GenBank 的所有ITS2 序列,共计34 条,对结果进行验证。结果：砂仁ITS2 序列比对后长度为230 bp,3个不同基原在135 bp 和199 bp 处存在稳定SNP（s）变异位点。结论：本研究开发的两个稳定的SNP（s）位点可以快速准确地鉴定砂仁药材3 个基原。     

DNA条形码技术鉴定贝母属植物

目的 采用DNA条形码技术,比较了条形码序列ITS1和ITS2在贝母属植物中的鉴定效果。方法 从8个贝母属21个样品中提取了基因组DNA,进行ITS1、ITS2序列的PCR扩增和测序,并比较了各样品DNA提取率、PCR扩增率及测序成功率。测序数据采用BLAST搜索法评价2种序列的鉴定能力,采用SPSS软件进行遗传距离分析,采用MEGA软件进行系统发育树的构建。结果 对比不同物种ITS1、ITS2序列的一级结构差异,发现其ITS1序列长度为205～229 bp,有信息位点27个（所占比例11.8%）,鉴定成功率为72.2%;ITS2序列长度为236～244 bp,有信息位点20个（所占比例8.2%）,鉴定成功率为100%。ITS1序列的种内及种间遗传距离分别为0.001 8和0.066 1,而ITS2序列的种内及种间遗传距离分别为0.000 5和0.046 8,且种内高度保守;系统发育树构建结果显示,2种ITS序列能准确区分出浙贝母类群、川贝母类群和北方贝母类群,而ITS2序列所构建的系统发育树准确度更高。结论 ITS2 序列能够更准确鉴定不同物种贝母,适合作为贝母属植物的通用条形码序列。     

基于ITS2序列的博落回属植物鉴定研究

目的:采用ITS2序列对博落回属药用植物进行鉴定。方法:通过对来自湖南、江西、浙江、湖北、河南、陕西、重庆的30个博落回属植物ITS2序列进行扩增和测序,并对其进行扩增效率及测序成功率、碱基构成、种内和种间变异分析及NJ系统进化树分析来评估ITS2序列鉴定效果。结果:博落回属药用植物ITS2序列长度在500 bp以内,扩增效率和测序成功率为100%,并获得30条博落回ITS2序列。结论:ITS2序列可以有效准确鉴别博落回属植物。     

基于ITS2 序列鉴定中药材金沸草、旋覆花及其近缘混伪品

目的：应用ITS2 序列鉴定中药材金沸草、旋覆花及其近缘种混伪品,以确保药材质量,保障临床安全用药。方法：通过对金沸草、旋覆花等药材的3 个基原物种条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花及其同属近缘物种进行DNA 提取、PCR 扩增ITS2 序列并双向测序,用CodonCode Aligner 对测序峰图进行拼接后,用MEGA5.0 软件进行相关数据分析,并构建NJ 系统聚类树以直观反映鉴定结果。结果：各基原物种ITS2 序列变异位点稳定,其种内平均K2P 距离均远小于各自药材以及同属近缘混伪品的种间平均K2P 距离;基于ITS2 序列的NJ 树可以将金沸草和旋覆花药材与同属其它近缘混伪品明显区分开。结论：ITS2 序列可准确鉴别中药材金沸草和旋覆花及其同属近缘混伪品。     

基于ITS2条形码鉴定水红花子及其混伪品

目的:利用ITS2条形码对中药材水红花子及其混伪品进行鉴定研究。方法:为对该中药材进行准确鉴定,共收集71份样本,包含药材正品及其混伪品。通过对样品进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,利用Codon Code Aligner软件进行序列质量评价与拼接,获得ITS2序列。用MEGA软件进行序列比对、变异位点及遗传距离分析,采用最近距离法和构建NJ(邻接)树法来评价ITS2条形码的鉴定能力。结果:水红花子药材基原物种红蓼ITS2序列种内遗传距离为0~0.0124,与其混伪品水蓼、酸模叶蓼以及春蓼的种间遗传距离分别为0.0334~0.0508、0.0688~0.0875、0.0379~0.0467。红蓼种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定水红花子与其混伪品。此外,基于ITS2序列构建的NJ树也可将水红花子及其混伪品明显区分开。结论:ITS2条形码是鉴别水红花子药材的有效工具,可为保障该药材生产投料安全提供新的技术手段。     

鸡血藤及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

目的采用分子生物学鉴定技术,筛选合适的DNA条形码序列,建立快速、准确鉴定鸡血藤的方法。方法采集72份鸡血藤及其混伪品的样本,分别提取样品DNA,对ITS2、matK、psbA-trnH、ITS和rbcL序列扩增、测序;计算各序列扩增成功率和测序成功率,利用MEGA7.0分析比对序列特征;基于Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型计算种内、种间的遗传距离评估Barcoding gap;利用Phylosuite软件构建ITS2、matK和psbA-trnH和多基因(I-M-P)联合系统发育树。结果 ITS2的扩增成功率和测序成功率最高,均为100%,matK和psbA-trnH的测序成功率亦有94.4%、91.7%,而rbcL和ITS仅为69.4%和61.1%;ITS2较其他条形码序列具有明显的Barcoding gap,且种内、种间重叠少;系统发育树显示,ITS2和psbA-trnH可将鸡血藤及其混伪品明显聚为不同分支,matK不能把滇鸡血藤和南五味子分开;I-M-P系统发育树同ITS2和psbA-trnH结果相同。结论以ITS2为主、psbA-trnH序列为辅的鉴定方法能够对鸡血藤及其混伪品进行快速、准确的鉴定,为鸡血藤临床用药的安全性和合理使用的准确性提供依据。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

ITS2条形码序列对海南大戟科植物的鉴定

目的利用DNA条形码技术评估ITS2序列对海南大戟科植物的鉴定能力。方法利用PCR测序法,对供试样本ITS2片段进行双向测序,所得序列经Codon Code Aligner拼接后,利用MEGA 6.0进行相关数据分析,构建邻接(NJ)树。利用TAXON DNA软件分析序列种内、种间变异并作barcoding gap分析。从ITS2数据库中获得供试样本的预测ITS2二级结构。结果大戟科供试样本ITS2序列中变异位点与信息位点分别占总序列长度的84%和69.67%。供试各种在构建的NJ树中均各自成束,表现出单系性;基于ITS2序列的种内最大变异距离值0.067 3;种间最小变异距离值0.119 1,各ITS2二级结构种内无明显差异;种间存在明显差异。结论所得ITS2条形码序列对海南大戟科植物鉴定能力强,可作为DNA条形码序列对海南大戟科植物进行快速鉴定。     

基于DNA条形码的甘草属植物的分子鉴别

目的:评价不同DNA条形码序列对甘草属的鉴定能力。方法:应用5条常用DNA条形码序列ITS、ITS2、psbA-trnH、matK与rbcL对甘草属进行PCR扩增与序列测序,结合在GenBank数据库下载的序列数据,通过分析各序列种内与种间变异与遗传距离,构建系统发育树,并基于相似性搜索算法和最近距离法计算各序列鉴定成功率,以分析比较各序列对甘草属的鉴定效率。结果:matk序列因扩增与测序成功率均较低,没有加入后续的数据分析。各个序列的鉴定成功率由高到低的顺序为psbA-trnH、ITS、ITS2、rbcL。ITS和ITS2序列种间最小变异均大于种内最大变异,且种内变异最小。Barcoding gap检验结果显示,ITS、ITS2的重叠区较小。NJ树结果显示,只有psbA-trnH序列能把甘草属不同物种分开。结论:利用DNA条形码序列可准确鉴别甘草属植物,psbA-trnH和ITS组合序列可作为鉴定甘草属植物的较优序列组合。本研究为甘草属植物的分子鉴别提供科学依据。     

王不留行种子的ITS2序列分子鉴定研究

目的：基于ITS2序列对中药材王不留行种子及其混伪品进行鉴定研究,为王不留行种子及其混伪品的鉴定提供新方法。方法：对王不留行种子及其混伪品样品提取基因组DNA、PCR扩增、双向测序获得ITS2序列。应用MEGA 6.0软件计算种内、种间遗传距离,构建邻接树,基于自行编写的代码和开源代码 PHP QR Code的编码方式,将王不留行及其混伪品 ITS2序列转换为条形码图片,获得各物种二维DNA条形码图片,并在中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）对所获得ITS2序列进行分析鉴定。结果：王不留行药材ITS2序列长度为219-221bp,种内最大K2P遗传距离为0.009,小于其与混伪品的种间K2P遗传距离,王不留行及其混伪品ITS2序列间存在的变异位点较多。NJ树结果表明王不留行与其混伪品分别聚为一支,可明显区分。结论：ITS2序列可以准确鉴别王不留行种子,为其种质资源鉴定和中药材种子质量标准的建立提供了新方法,将获得的ITS2序列转换为二维DNA条形码可为王不留行药材流通管理提供便利,为保障王不留行临床用药安全提供了新的技术手段。     

中药材北沙参种子DNA条形码鉴定研究

目的：本研究旨在建立鉴定北沙参种子的新方法,确保药材生产种植中种质基原准确。方法：对北沙参不同产地种子经初步形态特征鉴定后,取单粒种子为一份样品,提取基因组DNA、PCR扩增、双向测序拼接获得ITS2序列,结合序列比对、变异位点分析,基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）,系统地完成种子样品的分子鉴定。结果：研究表明66份种子样品中,64份与《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中北沙参序列特征一致,2份样品序列中各有一处SNP位点,为北沙参暂未发现过的遗传多样性信息,鉴定结果显示为北沙参。结论：DNA条形码技术能准确鉴定北沙参种子,并为中药材种子鉴定提供新方法,同时SNP位点的发现为后续研究北沙参品种多样性问题提供参考。     

基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定

目的：基于内转录间隔区（ITS）序列,运用DNA条形码技术对滇鸡血藤药材及其混伪品进行序列比对分析,根据单核苷酸多态性位点构建滇鸡血藤单倍型数据库,建立快速、准确鉴定滇鸡血藤的分子鉴定方法。方法：以滇鸡血藤及其混伪品为材料,利用DNA提取试剂盒,分别提取滇鸡血藤及其混伪品的总DNA,对ITS序列进行聚合酶链式反应扩增及测序分析,使用DNAMAN软件统计其片段长度及变异位点个数,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算Kimura2-parameter遗传距离,并利用邻接法建立系统发育树进行分析。结果：滇鸡血藤ITS序列片段长度为675 bp,共包括19种单倍型,与其主要混伪品的差异位点为212、223、224 bp,系统发育树显示,ITS序列能够区分滇鸡血藤及其混伪品。结论：ITS条形码可以作为区分鉴定滇鸡血藤及其混伪品的分子条形码,包含19个单倍型的单倍型数据库覆盖了滇鸡血藤全部的单倍型。     

药用多孔菌DNA条形码鉴定研究

目的:筛选采用DNA条形码技术鉴定药用多孔菌的有效条形码及该方法的可行性。方法:对29种药用多孔菌的69份样品进行DNA提取,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增ITS序列并进行双向测序,去除低质量区和引物区,得到ITS序列,通过BLAST比对及基于K2P遗传距离构建系统聚类NJ树开展ITS鉴定效率评价。结果:经过优化的DNA提取方法,可对所有样品成功提取到足量DNA,PCR扩增产物测序并经过序列拼接剪切后均能得到高质量ITS序列;物种内ITS最大遗传距离均远小于物种种间最小遗传距离;基于Gen Bank数据库进行BLAST比对,鉴定效率达到100%;基于K2P遗传距离构建NJ树,结果显示相同物种均聚为一支。结论:DNA条形码技术可以对多孔菌进行快速准确鉴定,ITS序列可作为药用多孔菌有效候选DNA条形码。     

中药材薄荷的DNA条形码鉴定研究

目的:利用DNA条形码鉴定技术快速、准确地鉴别中药材薄荷及其密切相关种。方法:提取薄荷药材及其易混品的DNA、对ITS2序列进行PCR扩增和测序,应用CodonCode Aligner V3.0对测序峰图进行校对拼接,去除低质量序列及引物区,获得ITS2序列。利用MEGA5.0软件计算物种种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、构建NJ系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果:薄荷药材与其他密切相关种之间的K2P遗传距离分布于0.071～0.231,大于薄荷种内K2P遗传距离(0～0.006);3种鉴定方法也表明ITS2序列适合鉴别薄荷药材与其密切相关种。结论:ITS2条形码可有效鉴别中药材薄荷及其易混品,为快速、准确地鉴定薄荷提供了科学依据。     

5种习用柴胡的ITS序列鉴别

目的:用PCR扩增方法测定5种常用柴胡的ITS序列,为柴胡的分子鉴定提供依据。方法:分别从5种柴胡的叶片中提取总DNA,以核基因组通用引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序。结果:各样品的ITS1长度为214～220bp,ITS2长度为230～231bp。5种柴胡的ITS序列分别有多个特异性信息位点。结论:ITS序列可以作为柴胡分子鉴定的依据。     

中药地枫皮及其伪品假地枫皮的DNA条形码鉴定

目的:评价和比较几个常用DNA条形码候选序列对地枫皮及伪品假地枫皮的鉴定作用。方法:采集不同产地的地枫皮及假地枫皮样品,进行总DNA提取,选取核基因内转录间隔区2(ITS2)序列、叶绿体rbcL,mat K基因序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,纯化产物测序,利用Condon Code Aligner V3. 7. 1校对拼接。结果:地枫皮及假地枫皮rbcL序列进行多次PCR扩增及测序结果均不理想,初步推测地枫皮及假地枫皮rbcL序列太长,进化较慢,不适合作为地枫皮及假地枫皮种间鉴别;地枫皮及假地枫皮的matK基因序列测序成功率分别为0和76. 8%,可能是不同类群的植物matK序列的引物标准不一;对地枫皮及假地枫皮的ITS2序列PCR扩增及测序结果最为理想,测序的成功率分别为89. 3%及91. 2%,对测序结果序列进行分析,地枫皮的ITS2序列总长度均为268个碱基,存在2个变异位点;假地枫皮的ITS2序列总长度均为430个碱基,存在4个或3个变异位点。实验结果说明地枫皮及假地枫皮ITS2序列较短,有明显的变异性,便于扩增,表明ITS2序列用于地枫皮及假地枫皮的分子鉴定优于rbcL和matK序列。结论:ITS2序列作为标准的DNA条形码能够有效地鉴定地枫皮及其伪品假地枫皮。     

基于ITS序列分析对紫花地丁的分子鉴别

目的:通过研究比较紫花地丁与其易混中药材ITS序列的差异和规律,建立紫花地丁与其易混药材之间的分子鉴别方法。方法:分别从紫花地丁和易混品中提取总DNA,用ITS序列通用引物扩增,扩增产物双向测序。结果:紫花地丁与其他易混品在ITS1和ITS2区段存在特异鉴别位点共8个。结论:根据ITS序列特征,能有效区分紫花地丁和其他易混中药材。ITS序列是紫花地丁鉴定的有效的分子标记。     

白芷药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定

目的:应用ITS2序列对白芷、杭白芷及其混伪品进行鉴定研究,为白芷药材的准确鉴定提供依据。方法:提取样品总DNA,扩增ITS2序列并双向测序,计算种间、种内Kimura-2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统邻接(NJ)树。结果:白芷的ITS2序列长度为227 bp,平均GC含量为55. 05%,种内最大K2P遗传距离为0. 009 2;杭白芷ITS2序列长度均为227 bp,GC含量为55. 07%,种内无变异位点。白芷与杭白芷种内最大遗传距离均远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离。NJ树结果显示白芷与杭白芷聚为一支,可与其他混伪品明显区分开。结论:ITS2序列能有效地鉴定白芷药材及其混伪品,为白芷药材市场流通管理及临床用药安全提供了新的技术手段,也为其他中药材及其混伪品的鉴定提供参考。