人骨髓基质细胞核移植重构胚的建立

目的建立人体细胞核移植技术，为治疗性克隆的实验研究及临床应用奠定基础。方法应用显微操作技术将单个人骨髓基质细胞注入去核后的兔卵母细胞内，经电融合、离子霉素和6．甲氨基嘌呤激活后．培养于含10％胎牛血清的TCM-199中，使重构胚进一步发育至囊胚。结果245枚卵母细胞进行去注核显微操作，核移植后有72．6％（178／245）卵母细胞仍保持完整；经电融合后细胞融合率为62．8％（83／132）：体外培养后约65％（54／83）的重构胚可进入分裂期，3．7％（2／54）发育至桑囊期，囊胚孵化率为100％（2／2）。结论兔卵母细胞能使人骨髓基质细胞核重新编程形成核移植重构胚并可继续发育至囊胚，使得从核移植重构囊胚分离胚胎干细胞用于实验和临床治疗研究成为可能。     

骨髓基质细胞移植治疗局灶性脑缺血

骨髓基质细胞 (ｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ)是一种非造血组织干细胞 ,它易粘附、易增殖 ,有自我更新的能力和多向分化的潜能。将一定数量的骨髓基质细胞通过脑立体定向术、静脉或颈内动脉注射移植到脑内后 ,能够明显改善局灶性脑缺血动物的神经行为功能。但是有关骨髓基质细胞移植治疗局灶性脑缺血的机制尚有待研究。一、骨髓基质细胞的生物学特性目前发现至少存在 3种形态的ＭＳＣｓ。Ｗｏｏｄｂｕｒｙ等发现 ,以低密度种植的大鼠ＭＳＣｓ为大而扁平的细胞 ;当接近汇合时 ,它们即转变成小的梭形细胞[1] 。Ｃｏｌｔｅｒ…     

菲立磁标记骨髓基质干细胞移植修复兔坐骨神经缺损

【背景】既往为明确细胞移植后对组织修复情况,多采用标本处死或取材等侵袭性方法,但此类方法创伤大且不适于人体研究。通过应用示踪剂标记移植细胞,采用无创伤性影像学技术活体识别、追踪移植细胞的存活及分化状态,观察组织再生修复情况,无疑对于提高细胞移植治疗有重要意义。 【目的】应用MRI影像学技术,体外追踪活体内菲立磁-多聚赖氨酸复合标记的骨髓基质干细胞移植后的存活、迁移变化及与宿主的整合情况。 【设计、时间及地点】细胞学体外观察,于2008年3月至12月在珠江医院神经外科实验室完成。 【材料】健康新西兰兔10只,由南方医科大学实验动物中心提供。菲立磁为Advanced Magnetic公司产品,多聚赖氨酸为Sigma公司产品。 【方法】无菌条件下抽取新西兰兔股骨骨髓,密度梯度离心法获取骨髓基质干细胞,收集细胞加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养基诱导5天。将50mg/L菲立磁和1.5mg/L多聚赖氨酸混合震荡30分钟后加入到神经培养基中进行标记,细胞孵育24小时后移植至坐骨神经缺损处。分别在细胞移植后1周、2周、4周、8周和16周行移植处MRI扫描及组织学观察。 【主要观察指标】骨髓基质干细胞经诱导后向神经干细胞分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁－多聚赖氨酸复合物对细胞增殖或分化的影响,利用MRI对标记后移植细胞观察的有效性。 【结果】1.骨髓基质干细胞体外培养能成功扩增、繁殖,经诱导分化成具有细长突起的神经干细胞。2.菲立磁-多聚赖氨酸复合物能在体外标记骨髓基质干细胞,标记效率达到98％且无明显渗漏。3.1周后MRI扫描可见坐骨神经细胞移植处局限性低信号改变,4和8周后信号区域改变增大,16周未见明显信号改变。HE染色发现细胞移植组神经纤维再生良好,体外菲立磁标记骨髓基质细胞移植后可在坐骨神经内存活并向神经两断端迁移。组织学改变基本上与核磁共振影像相对应。 【结论】1.骨髓基质干细胞经体外诱导能分化为神经干细胞并保持其增殖活性。2.菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且不影响标记后细胞的活性、增殖和分化能力。3.菲立磁标记的兔骨髓基质细胞源神经干细胞移植后,可在宿主坐骨神经内存活、迁移,T2WI序列成像可清晰显示Feridex标记的BMSCs所致的低密度影像改变。利用MRI可以对移植后的标记细胞进行活体追踪。     

pEGFP-C2基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起来的核转染技术直接将编码绿色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞的细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以NucleofectorTM技术转染pEGFP-C2(EGFP组),以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。EGFP的表达逐渐增强,至第6天达到最高峰(47.8%),观察一个月未发现表达减弱。结论pEGFP-C2基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响;EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记;NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型，观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型；待术后生长至3w和4w时行MRI检测；不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4．03w；对照组平均生存时间为3．88w；且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围，对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用，可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

骨髓基质细胞移植治疗脑缺血

脑缺血是临床上的常见病和多发病。现代药物及溶栓治疗的发展显示了对于急性期中风明显的功能保护作用；然而，神经损害一旦发生，对神经功能的恢复则显得治疗乏力。当前对于中风治疗的研究焦点集中在了干细胞，它不仅具有功能保护作用，而且使得细胞替代和功能恢复成为了可能。作为细胞治疗的种子细胞来源之一，骨髓基质细胞（BMSCs）分化潜能好，来源丰富，不存在胚胎干细胞移植所带来的伦理学问题。     

骨髓基质细胞移植治疗帕金森病河猴的实验研究

目的 探讨以骨髓基质细胞(BMSCs)为供体移植治疗帕金森病(PD)模型恒河猴的可行性.方法 应用立体定向手术毁损单侧黑质建立恒河猴PD模型,采用加拿大评分和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)分别观察恒河猴行为学和大脑黑质多巴胺转运蛋白(DAT)的变化,免疫荧光双标染色检测恒河猴黑质移植侧和正常侧BMSCs的分化状态.结果 移植BMSCs后恒河猴的PD综合征症状逐渐加重;SPECT检测显示恒河猴移植BMSCs前后黑质双侧DAT无明显变化,但免疫荧光显示移植后BMSCs分化为多巴胺(DA)能神经元的比例高达25%.结论 BMSCs无法作为有效的移植供体治疗PD,其可行性尚需进一步研究.     

移植人骨髓基质细胞治疗帕金森大鼠

骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）在体内外特定环境条件下可以分化为成骨细胞、神经细胞等.本文利用6-OHDA损毁内侧前脑束（medial forebrain bundle,MFB）制作帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）动物模型,移植BMSCs并观察BMSCs对PD大鼠行为学及组织学的影响,以探讨BMSCs治疗PD的前景.     

离心力对兔骨髓基质细胞成骨分化的影响*

背景：在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,离心力是一种促进因素。 目的：探讨离心力是否能促进复合于聚羟基乙酸共聚物材料上的兔骨髓基质细胞向成骨方向分化。 方法：全骨髓法分离培养兔骨髓基质细胞,贴壁法纯化,至细胞达80%融合时胰酶-EDTA消化传代,调整细胞浓度为1× 109 L-1。将聚羟基乙酸共聚物切割成5 mm×5 mm大小,预先浸泡入含血清培养基内24 h,然后将第3代骨髓基质细胞悬液按300 μL/块密度接种于支架材料表面,将复合物置入离心管底,细胞滴加面朝上,加入含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松的成骨诱导培养基。设立2组：离心力刺激组每间隔12 h将离心培养管置于离心机上,按1 000 r/min离心30 min,相对离心力132 g;对照组培养管中细胞不作离心静态培养。通过光镜观察及检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、组织钙含量,评估成骨细胞的分化水平。 结果与结论：体外培养第16天,离心力刺激组支架表面被多层细胞和矿化基质所覆盖,而对照组仅支架表层见一薄层细胞。与对照组比较,离心力刺激组培养后第2天碱性磷酸酶活性明显降低(P < 0.05),第4天碱性磷酸酶活性明显升高(P < 0.05)。在整个培养期间对照组骨钙素质量浓度一直维持低水平,离心力刺激组第12,16天骨钙素质量浓度明显高于对照组(P < 0.05)。培养16 d后离心力刺激组的钙质量浓度明显高于对照组(P < 0.05)。提示离心力能促进接种于聚羟基乙酸共聚物的兔骨髓基质细胞成骨分化,并形成矿化产物。     

人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

目的研究作为核移植供体细胞的人骨髓基质细胞相关生物学特性。方法应用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质细胞，并对其进行形态观察、免疫荧光分析细胞骨架结构、端粒酶活性测定、核型及细胞周期分析。结果培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架结构：在融合密度达80%-90%时，G0＋G1期细胞所占的比例较高，约占92．58％；检测传至第7代的人骨髓基质细胞具有正常染色体数目（46，XY），端粒酶活性为0．567。结论形态良好、染色体数目正常的人骨髓基质细胞可以作为核移植的供体细胞。     

趋化因子Fractalkine体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子Fractalkine对骨髓基质细胞(BMSCs)的体外迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠BMSCs,取第五代BMSCs行免疫荧光鉴定;后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1的情况,利用Boyden小室法探讨趋化因子Fractalkine对BMSCs的体外趋化作用及其特异性。结果第五代BMSCs都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin;CX3CR1细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1,趋化因子Fractalkine(5、50、500ng/mL)体外可趋化BMSCs迁移,抗Fractalkine多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论Fractalkine/CX3CR1通路参与BMSCs体外迁移,为进一步研究BMSCs的迁移机制提供了理论依据。     

Expression of brain natriuretic peptide by human bone marrow stromal cells

Bone marrow stromal cells (BMSC) have been shown to generate neural cells under experimental conditions in vitro and following transplantation into animal models of stroke and traumatic CNS injury. Hastened recovery from the neurological deficit has not correlated with structural repair of the lesion in the stroke model. Secretory functions of BMSC, such as the elaboration of growth factors and cytokines, have been hypothesized to play a role in the enhanced recovery of neurological function. Using gene expression arrays, real time RT-PCR and radioimmunoassay, we have found that brain natriuretic peptide (BNP) is synthesized and released by BMSC at physiologically relevant levels in vitro. BNP, like its close homolog atrial natriuretic peptide (ANP), exerts powerful natriuretic, diuretic and vasodilatory effects. We speculate that transplanted BMSCs facilitate recovery from brain and spinal cord lesions by releasing BNP and other vasoactive factors that reduce edema, decrease intracranial pressure and improve cerebral perfusion.     

核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响

目的研究以最近发展起来的核转染技术转染增强型绿荧光蛋白（EGFP）质粒进行基因修饰对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofector^TM技术转染pEGFP—C2（EGFP组），以同期培养未转染的细胞作为对照组（control组）。以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”＋10％胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。流式细胞仪检测转染效率。比较两组细胞的生长增殖以及Nestin、NSE、GFAP抗原的表达情况。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化以及生长曲线。诱导18d，两组细胞NSE、GFAP的表达比例无统计学意义。结论Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法；EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；核转染pEGFP-C2对兔原代骨髓基质细胞体外增殖及向神经细胞方向分化无明显影响。     

体外诱导获得雪旺细胞的可靠性研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)在体外条件下向周围神经雪旰细胞(SCs)分化的可靠性. 方法 分离提取SD大鼠股骨和胫骨部位BMSCs.利用其贴壁生长的特性.培养纯化,传代扩增.用复合诱导因子(β.巯基乙醇+全反式维甲酸+血小板凝集抑制剂+m小板源性生长因子+碱性成纤维细胞生长因子)在体外诱导BMSCs分化.免疫细胞化学方法 检测P75、S-100及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,荧光实时定量PCR检测P75、S100及CD104的表达. 结果诱导后的BMSCs形态类似SCs,免疫荧光染色鉴定其具有SCs性质,表达SCs的表面标志物(GFAP、S100和P75).荧光实时定量PCR结果显示诱导后BMSCs S-100、CD104的表达量达到了SCs的表达量水平,但P75的表达量与SCs的表达量水平还有较大差距. 结论 体外诱导BMSCs可部分获得SCs的特征,传代后恢复至未诱导状态,这种预诱导加复合因子诱导的方法 尚待完善.     

骨髓间质干细胞的分离培养及向神经细胞分化的研究

目的 研究骨髓间质干细胞的分离培养方法及其向神经元细胞分化的条件及可行性。方法 取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法，分离培养骨髓问质干细胞，经β-巯基乙醇诱导，骨髓问质干细胞可向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果 分离的骨髓间质干细胞可体外增殖，经β-巯基乙醇诱导，骨髓间质干细胞可向神经元细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征；分化后的细胞表达神经元标志物-神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微丝(NF)。结论 骨髓组织中存在着骨髓间质干细胞，易分离和培养，体外可增殖，可横向分化为神经元，从而为中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

骨髓基质细胞移植促进大鼠局灶性脑损伤血管生成的实验研究

目的研究骨髓基质细胞（BMSCs）移植对大鼠局灶性脑损伤血管生成的影响，探讨BMSCs移植修复大鼠脑损伤的机制。方法制备大鼠局灶性脑损伤动物模型，进行BMSCs移植，通过免疫组织化学、电镜等观察移植局部内皮细胞及微循环的变化。结果BMSCs移植后，局部凝血因子FⅧ染色阳性细胞数增加，染色加深，出现血管样结构；局部微血管内膜较光滑，内皮细胞间可见紧密连接，细胞核形态较规则，基底膜较完整，微血管管腔受压缓解。结论BMSCs移植促进损伤区周围内皮细胞增殖和新生血管形成。损伤区局部微循环得以改善进而修复脑损伤。     

成人骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞实验研究

目的探讨骨髓基质细胞的体外培养、扩增及诱导其向神经元样细胞定向分化的方法。方法采用改进的全骨髓培养法,培养来源于正常成人献髓者的骨髓基质细胞。传至第5代,用全反式维甲酸(RA)等细胞因子诱导分化,于诱导后第7d和第14d行神经元细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(β-tublin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定,计数诱导前后的细胞。结果成人骨髓基质细胞经RA 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 脑源性神经营养因子(BDNF)诱导后可见神经元样细胞出现,经NSE、MAP-2及β-tublin免疫组化和荧光鉴定阳性,NSE表达率达到48.5%±0.2%。结论骨髓基质细胞在体外扩增迅速,纯化需时短,并可在全反式维甲酸等细胞因子诱导下向神经元样细胞分化。     

骨髓基质细胞成年大鼠脑内移植

目的 研究骨髓基质细胞脑内移植后的分布和移行，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法 常规培养大鼠骨髓基质细胞，应用免疫组织学方法对细胞进行鉴定，Hoechst33258标记细胞，立体定向移植到大鼠的纹状体，经过一段时间后处死大鼠，脑组织切片，直接在荧光显微镜下检查存活的细胞。结果 细胞移植到大鼠脑内能够长时间存活，移植细胞与宿主细胞有很好的相容性，宿主脑组织的结构无破坏，移植细胞能够移行一段距离，说明脑内存在的信号诱导细胞向一定的方向迁徙。结论 骨髓基质细胞脑内移植后，能够与宿主脑组织整合在一起，无细胞过度增生和胶质瘢痕形成，这种细胞可能成为中枢神经系统自体移植的细胞来源。