外源性胶质细胞源性神经营养因子对周围神经损伤大鼠脊髓运动神经元的保护作用

目的：观察周围神经损伤后外源性胶质细胞源性神经营养因子对脊髓运动神经元的保护作用。 方法：成年SD大鼠随机分为2组，对照组（手术＋等渗盐水组）和实验组（手术＋胶质细胞源性神经营养因子组）。采用切断大鼠坐骨神经近端套接单盲管的实验模型。术后3d，1，2，4，8和12周处死动物并取材，对L4-6节段脊髓前角标本冰冻切片，行苏木精-伊红染色，内氏体染色、胆碱酯酶染色、原位末端标记法染色、电镜观察。 结果：①两组大鼠脊髓前角运动神经元的存活率变化：1，2，4，8，12周实验组较对照组显著提高（对照组86．5％，64．4％，60．9％，58．8％，58．5％，53．5％；实验组88．7％，71．5％，79．9％，79．3％，72．4％。69．9％．P〈0．05）。②神经元酶学功能评价：实验组胆碱酯酶阳性颗粒面积均比对照组有提高约20％（P〈0．05）③原位末端标记法染色凋亡细胞计数（每张切片凋亡细胞个数）：对照组为10．24&;#177;3．82；实验组为4．53&;#177;2．16。④神经元超微结构：实验组电镜观察神经元胞体形态改变，没有发现典型凋亡小体。 结论：外源性胶质细胞源性神经营养因子能防止成年大鼠神经损伤后运动神经元的退行性变死亡，对脊髓运动神经元有保护作用。     

控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕

背景：前期研究发现控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞联合移植可有效促进猕猴脊髓损伤后运动功能和感觉功能的恢复。
　　目的：观察控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植抑制猴脊髓损伤后胶质瘢痕形成的作用是否优于单纯细胞移植。
　　方法：取12只恒河猴,采用改良Al en氏法制作急性重度脊髓损伤模型,随机数字表法分为3组,实验组以控释胶质细胞源性神经营养因子联合自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复,对照组以自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复,空白对照组以磷酸盐缓冲液修复。修复后5个月,取出脊髓组织制成石蜡标本,应用免疫组织化学染色显示胶质瘢痕的形态特征、构成特点及瘢痕中神经纤维的再生情况,检测胶质瘢痕面积及胶质纤维酸性蛋白染色的平均吸光度值。
　　结果与结论：脊髓损伤部位胶质瘢痕由混合性增生的星形胶质细胞和组织细胞构成。空白对照组脊髓胶质瘢痕累及范围广,星形胶质细胞增生显著,神经丝蛋白免疫组织化学染色阴性,胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值高于实验组与对照组(P<0.05);实验组、对照组脊髓胶质瘢痕累及范围较局限,神经丝蛋白免疫组织化学染色显示有少量神经纤维通过瘢痕区,并且实验组胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值低于对照组(P<0.05)。结果表明,控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植可更强抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成。     

胶质细胞源性神经营养因子对培养脊髓运动神经元的影响

背景:胶质细胞源性神经营养因子对运动神经元具有营养作用,但不同浓度的营养因子对培养运动神经元体外生长影响的作用缺乏量化数据。目的:采用体外培养胚胎大鼠的脊髓运动神经元,观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对其生长活性的作用。设计:以体外培养细胞为对象的验证性观察。单位:河北医科大学第二医院神经内科。材料:实验于2001-01/2002-09在河北医科大学第二医院神经内科实验室完成。选择成年清洁级雌雄SD大鼠合笼,取孕15d的大鼠胚胎进行脊髓分离。方法:取孕鼠15d胚胎的脊髓腹侧半组织进行原代体外分离培养。胶质细胞源性神经营养因子组按浓度1,10,50,100μg/L分为4组。对照组为不含胶质细胞源性神经营养因子的培养液。各组设立8个复孔,共做2个批次。从细胞形态学及应用MTT法观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓运动神经元的影响。主要观察指标:培养运动神经元的细胞存活数目和细胞突起的长度。结果:①脊髓运动神经元细胞突起的长度比较:胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(107.4±35.4068,160.5±38.5649,450.5±60.6403,293.5±67.3814,82.8±7.9725)μm,t=2.610-2.647,P<0.01]。②细胞存活数:胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(13.9±0.8999,16.1±0.6680,20.1±0.6679,26.0±0.6030,10.5±0.7820)μm,t=2.211-2.312,P<0.05]。③MTT比色微量分析:胶质细胞源性神经营养因子1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组和100μg/L组明显高于对照组[(0.350±0.0598,0.3667±0.0719,0.3819±0.0638,0.3953±0.0605,0.2858±0.0325)μm,t=2.259-2.577,P<0.05]。结论:不同浓度胶质细胞源性神经营养因子对体外培养大鼠胚胎脊髓运动神经元有不同程度的促生长作用。     

睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白表达的影响

背景:睫状神经营养因子具有多种生物活性,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有重要意义.目的:观察睫状神经营养因子对坐骨神经切断吻合后大鼠相应脊髓节段前角星形胶质细胞的特异标记物胶质纤维酸性蛋白表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、生理盐水组及药物组.除对照组外,对所有大鼠实施双侧坐骨神经切断吻合术,药物组手术区局部注射睫状神经营养因子100 ng/kg,1次/d,生理盐水组局部注射等量生理盐水.术后1,3,7,14,21,28 d取相应脊髓节段,免疫组织化学染色观察胶质纤维酸性蛋白的表达,苏木精伊红染色、TUNEL染色对脊髓前角神经元进行计数.结果与结论:大鼠坐骨神经切断吻合后相应脊髓节段星形胶质细胞胞体大,突起分枝多且粗大,神经元数目逐渐减少,凋亡神经元增多,胶质纤维酸性蛋白表达增高.与模型组和生理盐水组比较,药物组神经元存活数目增多,凋亡减少,胶质纤维酸性蛋白表达明显增加(P<0.05或P<0.01).同时,药物组大鼠的运动功能障碍较轻,恢复较快.说明睫状神经营养因子可以通过促进大鼠脊髓前角胶质纤维酸性蛋白的表达起到神经保护作用.     

睫状神经营养因子对外周神经损伤后运动神经元的保护作用

目的:研究睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经损伤后运动神经的保护作用。方法:取成年SD大鼠27只,摸球法随机分为对照组、睫状神经营养因子(CNTF)组和生理盐水(NS)组。将大鼠右侧坐骨神经于梨状肌下缘0.5cm处锐性切断,硅胶管套接神经,将CNTF和生理盐水(NS)分别加入管中。于术后3,6,12,24d取L4～6脊髓作TUNEL标记检测,切片作苏木精-伊红染色计算脊髓内神经元的数目。结果:与对照组相比,CNTF组的神经元数目有明显的改善,其脊髓运动神经元计数3,6,12,24d分别为(83.3±1.2)%,(85.1±1.3)%,(85.6±1.2)%,(82.4±1.5)%(P<0.05,t=0.328),TUNEL标记运动神经元个数3,6,12,24d分别为(3.1±1.2)%,(8.8±1.5)%,(5.6±1.1)%,(4.5±1.7)%(P<0.05,t=0.614)。结论:CNTF通过抑制运动神经元的凋亡对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元损害具有保护作用。     

许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致神经元死亡的干预

背景:许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种相对分子质量为58000的神经营养物质,具有明显的神经营养活性,能对抗一氧化氮神经毒性物质。目的:建立根性撕脱伤动物模型,观察许旺细胞源神经营养因子对脊神经根性撕脱所致脊髓前角运动神经元死亡的保护作用。设计:重复观察测量。单位:深圳市第二人民医院骨三科,中山大学附属第一医院显微外科。材料:实验于2003-03/05在中山大学医学院实验动物中心完成。选用清洁级3～4月龄SD大鼠20只,随机分为许旺细胞源神经营养因子组、生理盐水对照组,各10只。两组动物均以左侧为正常侧,右侧为损伤侧。方法:①两组大鼠均建立颈6,7神经根性撕脱伤动物模型。②许旺细胞源神经营养因子组将一小块预浸有质量浓度为1g/L的许旺细胞源神经营养因子40μL的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面,生理盐水对照组将一小块预浸有等量生理盐水的明胶海绵覆盖于损伤侧硬膜囊表面。③明胶海绵表面置硅胶管,硅胶管一端与明胶海绵缝扎,另一端用凡士林封闭固定于皮下,关闭切口后伤口局部肌肉注射青霉素预防感染。术后两组动物分别通过硅胶管定期注射许旺细胞源神经营养因子或生理盐水20μL,1次/周,3周后取材。④切取颈6,7脊髓节段,观察损伤侧脊髓前角运动神经元的存活率和形态学变化以及一氧化氮合酶的表达。主要观察指标:①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化。结果:实验选用20只大鼠,全部进入结果分析。①脊髓运动神经元存活情况和形态学变化:颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧68.6%的运动神经元死亡,存活率31.4%,明显低于正常侧(P<0.01),且存活的神经元胞体严重萎缩;许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元的死亡率较生理盐水对照组减少35%(P<0.01),存活率为66.4%,且存活的神经元胞体代偿性增大,基本与正常侧相似(P>0.05)。②脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达的变化:正常情况下,脊髓中的一氧化氮合酶阳性神经元主要见于后角浅层,中央导水管周围、中间外侧柱和脊髓背根神经节中的内脏传入神经元,前角运动神经元不表达一氧化氮合酶。颈6,7神经根性撕脱术后3周,生理盐水对照组损伤侧脊髓运动神经元一氧化氮合酶表达明显增多,而其正常侧和许旺细胞源神经营养因子组损伤侧脊髓运动神经元均未见一氧化氮合酶表达增加。结论:脊神经根性撕脱可引起脊髓前角运动神经元的死亡和一氧化氮合酶表达,许旺细胞源神经营养因子则对受损的神经元有明显的保护作用和抑制一氧化氮合酶表达。提示许旺细胞源神经营养因子的神经元保护作用可能是通过改变神经元的一些细胞分子例如一氧化氮合酶而实现的。     

控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植可减少脊髓损伤后空洞形成

背景:前期研究发现控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植可以有效地促进猕猴脊髓损伤后运动功能的恢复。目的:验证控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植对猴脊髓损伤后组织结构的保护作用是否优于单纯细胞移植。方法:将急性重度脊髓损伤模型恒河猴分为3组,联合移植组采用控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植,单纯细胞移植组给予神经元样细胞移植,对照组给予磷酸盐缓冲液。制备脊髓组织石蜡标本,苏木精-伊红染色后显微镜下观察空洞形成情况,并应用图像分析系统计算空洞面积。结果与结论:对照组脊髓结构严重破坏,空洞面积大、累及范围广;单纯细胞移植组脊髓结构保存较好,有小面积空洞,偶有较大空洞形成;联合移植组脊髓结构保存最好,仅存在小面积空洞。组间两两比较差异有显著意义(P<0.01)。提示与单纯神经元样细胞移植比较,控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植对脊髓损伤后组织结构的保护作用更佳,可以在更大程度上减少脊髓空洞的形成可能是其作用机制之一。     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的:观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞,对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:实验于2004-07/12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只。空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞,28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。结果:68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果:脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损,驻杆时间减少超过30%,单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力,分别为对照的36%和65%,神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想,可达到正常对照的93%以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果:许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量:(22.7±1.9),(31.3±5.3),(12.9±3.0)个/视野;平均吸光度:0.035±0.021,0.075±0.033,0.023±0.011,P均<0.01]。结论:外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞,能够更加优化神经修复微环境,有利于神经损伤后修复。     

胶质细胞源性神经营养因子缓释微球及NogoA、硫酸软骨素酶ABC缓释微球联合促大鼠损伤脊髓再生神经功能的修复

背景:前期研究证实胶质细胞源性神经营养因子促损伤脊髓再生修复效果良好。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子、NogoA与硫酸软骨素ABC缓释微球联合促进大鼠损伤脊髓再生运动功能修复的作用。方法:取64只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组(仅行椎板切除)、模型组、胶质细胞源性神经营养因子组、胶质细胞源性神经营养因子微球组、硫酸软骨素ABC微球组、NogoA抗体微球组、联合组(胶质细胞源性神经营养因子微球+硫酸软骨素ABC微球+NogoA抗体微球)。后6组制备T10脊髓完全横断伤模型,于脊髓断端间缓慢注射一半相应药液,另用一块明胶海绵吸附另一半相应药液覆盖断端背面。结果与结论:①BBB运动功能评分:术后5,6,7,8,9,10周,联合组评分高于模型组、胶质细胞源性神经营养因子组、胶质细胞源性神经营养因子微球组、硫酸软骨素ABC微球组、NogoA抗体微球组(P<0.05)。②术后10周皮质体感诱发电位:假手术、模型组、胶质细胞源性神经营养因子组均未检测出。联合组主反应潜伏期低于其他各组(P<0.05),但高于正常对照组(P<0.05);主反应峰峰值高于其他各组(P<0.05),但低于正常对照组(P<0.05)。说明胶质细胞源性神经营养因子缓释微球及NogoA、硫酸软骨素ABC缓释微球联合促大鼠损伤脊髓再生神经功能修复效果优于单用胶质细胞源性神经营养因子缓释微球。     

胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化

背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点。②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果。③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(χ2=24.15,19.56,25.32,P<0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(χ2=24.45,23.79,P<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用。